310 10*1mm ಸ್ಟೇನ್‌ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ ಸುರುಳಿಯಾಕಾರದ ಕೊಳವೆಗಳ ರಾಸಾಯನಿಕ ಘಟಕ, ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್‌ನ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳು ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ನಿಶ್ಚಲತೆಗೆ ವೇದಿಕೆಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತವೆ.

Nature.com ಗೆ ಭೇಟಿ ನೀಡಿದ್ದಕ್ಕಾಗಿ ಧನ್ಯವಾದಗಳು.ನೀವು ಸೀಮಿತ CSS ಬೆಂಬಲದೊಂದಿಗೆ ಬ್ರೌಸರ್ ಆವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತಿರುವಿರಿ.ಉತ್ತಮ ಅನುಭವಕ್ಕಾಗಿ, ನೀವು ನವೀಕರಿಸಿದ ಬ್ರೌಸರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ನಾವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತೇವೆ (ಅಥವಾ ಇಂಟರ್ನೆಟ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ಲೋರರ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮೋಡ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿ).ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ನಡೆಯುತ್ತಿರುವ ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ನಾವು ಶೈಲಿಗಳು ಮತ್ತು JavaScript ಇಲ್ಲದೆ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ.
ಪ್ರತಿ ಸ್ಲೈಡ್‌ಗೆ ಮೂರು ಲೇಖನಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಸ್ಲೈಡರ್‌ಗಳು.ಸ್ಲೈಡ್‌ಗಳ ಮೂಲಕ ಚಲಿಸಲು ಹಿಂದಿನ ಮತ್ತು ಮುಂದಿನ ಬಟನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ಅಥವಾ ಪ್ರತಿ ಸ್ಲೈಡ್ ಮೂಲಕ ಚಲಿಸಲು ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಸ್ಲೈಡ್ ನಿಯಂತ್ರಕ ಬಟನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ.

ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ

310 10*1mm ಸ್ಟೇನ್ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ ಸುರುಳಿಯಾಕಾರದ ಕೊಳವೆಗಳ ಪೂರೈಕೆದಾರರು

ರಾಸಾಯನಿಕ ಸಂಯೋಜನೆ

ಯಾಂತ್ರಿಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು

ಮರುಸಂಯೋಜಿತ ಸ್ಪೈಡರ್ ರೇಷ್ಮೆ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು (ಸ್ಪೈಡರ್ ಸಿಲ್ಕ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು) ಹೊಸ ಜೈವಿಕ ವಸ್ತುಗಳ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯಲ್ಲಿ ಅನೇಕ ಸಂಭಾವ್ಯ ಅನ್ವಯಿಕೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ, ಆದರೆ ಅವುಗಳ ಬಹುಮಾದರಿ ಮತ್ತು ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆ-ಪೀಡಿತ ಸ್ವಭಾವವು ಅವುಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಕಷ್ಟವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಬಳಸಲು ಸುಲಭವಾಗುತ್ತದೆ.ಪುನರ್ಸಂಯೋಜಕ ಚಿಕಣಿ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಡೊಮೇನ್ (NT) ಸ್ವತಃ 37 °C ನಲ್ಲಿ ಸ್ವಯಂ-ಪೋಷಕ ಮತ್ತು ಪಾರದರ್ಶಕ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ.NT ಮತ್ತು ಹಸಿರು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಥವಾ ಪ್ಯೂರಿನ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಸೈಡ್ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಸ್ ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಸಂಪೂರ್ಣ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ.ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್ಗಳು.ಮರುಸಂಯೋಜಕ NT ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಪಾರದರ್ಶಕತೆ, ಕ್ರಾಸ್‌ಲಿಂಕ್ ಮಾಡದೆಯೇ ಜಿಲೇಶನ್ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಸಕ್ರಿಯ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ನೇರ ನಿಶ್ಚಲತೆಯಂತಹ ಆಕರ್ಷಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ನೀಡುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.
ಜೇಡಗಳು ಏಳು ವಿಭಿನ್ನ ರೇಷ್ಮೆ ಗ್ರಂಥಿಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ, ಪ್ರತಿಯೊಂದೂ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ರೀತಿಯ ರೇಷ್ಮೆಯನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ.ಎಲ್ಲಾ ಏಳು ರೇಷ್ಮೆ ಜಾತಿಗಳು ಸ್ಪೈಡರ್ ರೇಷ್ಮೆ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ (ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್‌ಗಳು) ಸುಮಾರು 6000 ಉಳಿಕೆಗಳಿಂದ ಕೂಡಿದೆ ಮತ್ತು ಗೋಳಾಕಾರದ N- ಮತ್ತು C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳಿಂದ (NT ಮತ್ತು CT) 1,2 ಸುತ್ತುವರೆದಿರುವ ದೊಡ್ಡ ಕೇಂದ್ರ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತದೆ.ಹೆಚ್ಚು ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲಾದ ರೇಷ್ಮೆ ಪ್ರಕಾರ, ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಆಂಪುಲ್ಲಾ, ಪ್ರಾಥಮಿಕ ಆಂಪುಲ್ಲಾ ಗ್ರಂಥಿಯಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುತ್ತದೆ.ಈ ಗ್ರಂಥಿಯಲ್ಲಿ, ಎಪಿಥೇಲಿಯಲ್ ಕೋಶಗಳ ಏಕಪದರವು ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳನ್ನು ಗ್ರಂಥಿಯ ಲುಮೆನ್‌ಗೆ ಸ್ರವಿಸುತ್ತದೆ, ಅಲ್ಲಿ ಅವು ಅತ್ಯಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ (30-50% w/v) 3,4 ನಲ್ಲಿ ಕರಗುವ ರೂಪದಲ್ಲಿ (ಡೋಪಿಂಗ್) ಇರುತ್ತವೆ.ಗ್ರಂಥಿಯಲ್ಲಿನ ಮುಖ್ಯ ಆಂಪ್ಯುಲರ್ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳ ಸಂಘಟನೆ ಮತ್ತು ರಚನೆಯು ಚರ್ಚೆಗೆ ಒಳಪಟ್ಟಿದೆ, ಆದರೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಪುರಾವೆಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಸುರುಳಿಯಾಕಾರದ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಸುರುಳಿಯ ರಚನೆ ಮತ್ತು ಮೈಕೆಲ್ಲರ್ ಅಥವಾ ಲ್ಯಾಮೆಲ್ಲರ್ ರಚನೆಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ 5,6,7,8,9,10ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳು ರೇಷ್ಮೆ ಫೈಬರ್‌ಗಳ ಯಾಂತ್ರಿಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ, β-ಶೀಟ್ ನ್ಯಾನೊಕ್ರಿಸ್ಟಲ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಅಸ್ಫಾಟಿಕ ರಚನೆಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ 11,12,13,14,15, ಅಂತಿಮ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳು ರೇಷ್ಮೆ ಗ್ರಂಥಿಯ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಬದಲಾಗುತ್ತಿರುವ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ರೇಷ್ಮೆ ಫೈಬರ್‌ಗಳನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತವೆ.ರೇಷ್ಮೆ ರಚನೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಮೂಲಕ, 19. ಟರ್ಮಿನಲ್ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು ವಿಕಸನೀಯವಾಗಿ ಸಂರಕ್ಷಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಕಾರ್ಯವು ಎಲ್ಲಾ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿದೆ 2,20,21.ಗ್ರಂಥಿಯ ಮೂಲಕ ಹಾದುಹೋಗುವ ಸಮಯದಲ್ಲಿ, ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್‌ನ pH ಸುಮಾರು 7.6 ರಿಂದ <5.716 ಕ್ಕೆ ಕಡಿಮೆಯಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕ್ರಮೇಣ ಕಿರಿದಾಗುವ ನಾಳದ ಮೂಲಕ ಚಲನೆಯಿಂದ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆಯಿಂದ ಕತ್ತರಿ ಮತ್ತು ಹಿಗ್ಗಿಸುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಾಗುತ್ತದೆ.ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ, CT ಒಂದು α-ಹೆಲಿಕಲ್ ಕನ್ಸ್ಟಿಟ್ಯೂಟಿವ್ ಸಮಾನಾಂತರ ಡೈಮರ್17, ಆದರೆ ಕಡಿಮೆ pH ಮತ್ತು ಕತ್ತರಿ ಬಲಗಳಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ, CT ತೆರೆದುಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ ಮತ್ತು β-ಲೇಯರ್‌ಗಳನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸುತ್ತದೆ16, 17, ಪ್ರಾಯಶಃ β-ಪದರಗಳನ್ನು ಪರಿವರ್ತಿಸುವ 16 ರ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಪ್ರದೇಶಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಚೋದಿಸುತ್ತದೆ. NT ಮಾನೋಮೆರಿಕ್ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಗ್ರಂಥಿಯ ಲುಮೆನ್‌ನಲ್ಲಿನ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುವ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳು ಮತ್ತು ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್‌ನ ಕರಗುವಿಕೆಯನ್ನು ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಆದರೆ ಕಡಿಮೆ pH ನಲ್ಲಿ, ಹಲವಾರು ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಲಿಕ್ ಆಸಿಡ್ ಸೈಡ್ ಚೈನ್‌ಗಳ ಪ್ರೋಟೋನೇಶನ್ ಸುಮಾರು 6.5 pKa ಯೊಂದಿಗೆ NT ಯ ಡೈಮರೈಸೇಶನ್‌ಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಇದರಿಂದಾಗಿ NT ಅನ್ನು ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸ್ಪೈಡ್ರೊಯಿನ್ ಅನ್ನು ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ. ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ.ಜಾಲಗಳು16,18.ಹೀಗಾಗಿ, NTಯು ಫಿಲಾಮೆಂಟ್ ರಚನೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರಮುಖ ಪಾತ್ರವನ್ನು ವಹಿಸುತ್ತದೆ, ಲೇಪನದಲ್ಲಿನ ಮೊನೊಮರ್‌ನಿಂದ ಫೈಬರ್23,24,25 ನಲ್ಲಿನ ಡೈಮರ್‌ಗೆ ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ.ದಿನಾಂಕ16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 ರವರೆಗೆ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲಾದ ಎಲ್ಲಾ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ NT ಹೆಚ್ಚು ಕರಗಬಲ್ಲ ಮತ್ತು ಹೆಲಿಕಲ್ ಆಗಿ ಉಳಿದಿದೆ, ಇದು ಭಿನ್ನರೂಪದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ ಕರಗುವ-ವರ್ಧಿಸುವ ಲೇಬಲ್‌ನಂತೆ ಅದರ ಅಭಿವೃದ್ಧಿಯನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಿತು.
ಒಂದು NT, ಒಂದು ಸಣ್ಣ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಪ್ರದೇಶ, ಒಂದು CT ಮತ್ತು ಶುದ್ಧೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ His6 ಟ್ಯಾಗ್ (His-NT2RepCT) ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಮಿನಿ ಸ್ಪೈಡರ್ ರೇಷ್ಮೆ ಪ್ರೋಟೀನ್, ಸ್ಥಳೀಯ ಸ್ಪೈಡರ್ ರೇಷ್ಮೆ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನಂತೆ ಜಲೀಯ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಕರಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ರೇಷ್ಮೆ ಜೇಡದ ಸ್ಥಳೀಯ ಪ್ರಮುಖ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಅನುಕರಿಸುತ್ತದೆ. .ವ್ಯಾಪ್ತಿ 25.31.ಅವನ-NT2RepCT ಅನ್ನು ಬಯೋಮಿಮೆಟಿಕ್ ಯಂತ್ರವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಿರಂತರ ಫೈಬರ್‌ಗಳಾಗಿ ತಿರುಗಿಸಬಹುದು, ಇದರಲ್ಲಿ pH 8 ಕರಗುವ ಲೇಪನವನ್ನು pH 525,32,33,34,35 ನೀರಿನ ಸ್ನಾನಕ್ಕೆ ಹೊರಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.ಅವನ-NT2RepCT ಅನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ E. ಕೊಲಿಯ ಬಯೋರಿಯಾಕ್ಟರ್ ಹುದುಗುವಿಕೆ ಮತ್ತು ನಂತರದ ನಂತರದ ಚಿಕಿತ್ಸೆಯು ಶುದ್ಧೀಕರಣದ ನಂತರ > 14 g/L ಇಳುವರಿಯನ್ನು ಉಂಟುಮಾಡಿತು.ಹೆಚ್ಚಿನ ಇಳುವರಿ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಕರಗುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಆಮ್ಲೀಯ ಸ್ಥಿತಿಗಳಿಗೆ His-NT2RepCT ಯ ಸಮರ್ಪಕ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯು NT23, 25, 34 ಗೆ ಕಾರಣವಾಗಿದೆ.
37 °C ನಲ್ಲಿ ಪ್ರೊಟೀನ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ ಕೇವಲ NT ಸೇರಿದಂತೆ, ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ ಪಾರದರ್ಶಕ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳ ತ್ವರಿತ ರಚನೆಯನ್ನು ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ.ಥಿಯೋಫ್ಲಾವಿನ್ ಟಿ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ (ThT), ಫೋರಿಯರ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫಾರ್ಮ್ ಇನ್‌ಫ್ರಾರೆಡ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (FTIR), ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಮ್ಯಾಗ್ನೆಟಿಕ್ ರೆಸೋನೆನ್ಸ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (NMR) ಮತ್ತು ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಮಿಷನ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (TEM) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು NT ಮತ್ತು ಮೈಕ್ರೋಸ್ಪೈಡರ್ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳು β-ರೀತಿಯ ಫೈರ್‌ಶೀಟ್‌ಗಳಾಗಿ ರಚನಾತ್ಮಕ ರೂಪಾಂತರಕ್ಕೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ಜೆಲ್ಗಳು ರೂಪುಗೊಂಡಾಗ.ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, NT ಮತ್ತು ಹಸಿರು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ (GFP) ಅಥವಾ ಪ್ಯೂರಿನ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಸೈಡ್ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಸ್ (PNP) ಯ ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಸಂಪೂರ್ಣ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಸಮ್ಮಿಳನ ತುಣುಕುಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ.ಭೌತಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳ ಕ್ಷಿಪ್ರ ರಚನೆಯೊಂದಿಗೆ ಹೆಟೆರೊಲಾಜಸ್ ಹೋಸ್ಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ-ಥ್ರೋಪುಟ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ, ಎಂಜಿನಿಯರಿಂಗ್ ಕಾರ್ಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳ ವೆಚ್ಚ-ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಉತ್ಪಾದನೆಯ ಸಾಧ್ಯತೆಯನ್ನು ತೆರೆಯುತ್ತದೆ.
ಹೆಚ್ಚಿನ ವರದಿಯಾದ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳಿಗಿಂತ ಭಿನ್ನವಾಗಿ, ಅವನ-NT2RepCT pH 8 ನಲ್ಲಿ Tris-HCl ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮಳೆಯಿಲ್ಲದೆ 500 mg/mL ವರೆಗೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಬಹುದು25.ಆದ್ದರಿಂದ, ಈ ಪ್ರೊಟೀನ್ 37 ° C (Fig. 1b-d) ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡುವಾಗ ದೃಗ್ವೈಜ್ಞಾನಿಕವಾಗಿ ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ, ಸ್ವಯಂ-ಬೆಂಬಲಿತ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಕಂಡು ನಮಗೆ ಆಶ್ಚರ್ಯವಾಯಿತು.ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಹಿಸ್-NT2RepCT ಜಿಲೇಶನ್ ವ್ಯಾಪಕ ಶ್ರೇಣಿಯ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ (10-300 mg/mL) ಸಂಭವಿಸಿದೆ ಮತ್ತು ಈ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಜಿಲೇಶನ್ ಸಮಯದೊಂದಿಗೆ ವಿಲೋಮವಾಗಿ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (Fig. 1c ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ. 1).His-NT2RepCT ಯ ಯಾವ ಭಾಗಗಳು ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್ ರಚನೆಗೆ ಮಧ್ಯಸ್ಥಿಕೆ ವಹಿಸುತ್ತವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲು, ನಾವು ಪ್ರತಿ ಡೊಮೇನ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಮತ್ತು ವಿವಿಧ ಸಂಯೋಜನೆಗಳಲ್ಲಿ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ವಿಲೋಮ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪರಿಶೀಲಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 1a,b).ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್‌ನ ಎಲ್ಲಾ ಪರೀಕ್ಷಿತ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳು 1 ಗಂಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಅವಧಿಯಲ್ಲಿ ಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು (300 mg/mL ನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ) ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ, ಅವಕ್ಷೇಪಿತ 2Rep (Fig. 1b) ಹೊರತುಪಡಿಸಿ.NT ಮತ್ತು CT ಮಾತ್ರ ಸಂಯೋಜನೆಯಲ್ಲಿ ಅಥವಾ ಪುನರಾವರ್ತನೆಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿತವಾಗಿ, 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಜೆಲ್ ಮಾಡಬಹುದು ಮತ್ತು His6 ಟ್ಯಾಗ್ ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಮೇಲೆ ಯಾವುದೇ ಗಮನಾರ್ಹ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಇದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಎನ್‌ಟಿಯು ಹೆಚ್ಚು ಕರಗಬಲ್ಲ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರವಾದ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಆಗಿದೆ ಮತ್ತು ರಿಕಾಂಬಿನೆಂಟ್ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳ ಹಿಂದಿನ ವರದಿಗಳು ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಪ್ರದೇಶಗಳು ಮತ್ತು/ಅಥವಾ CT ಗಳಲ್ಲಿನ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳಿಗೆ ಜಿಲೇಶನ್ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಕಾರಣವೆಂದು ಸಾಮಾನ್ಯ ಕಲ್ಪನೆಯನ್ನು ನೀಡಲಾಗಿದೆ, NT ಸ್ವತಃ ಮಾಡಬಹುದು.ಜಿಲೇಶನ್‌ನ ಆವಿಷ್ಕಾರವು ಅನಿರೀಕ್ಷಿತವಾಗಿತ್ತು.ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 1) 37, 38, 39. ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, NT ಈಗಾಗಲೇ 10 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c) ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಜೆಲ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.NT ಯ ವಿವಿಧ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳೊಂದಿಗೆ ವೈಲ್ ವಿಲೋಮ ಪ್ರಯೋಗಗಳು> 50 mg/mL ನಲ್ಲಿ NT ದ್ರಾವಣವು ಅನುಗುಣವಾದ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ His-NT2RepCT ಗಿಂತ ವೇಗವಾಗಿ ಜೆಲ್ ಆಗಿರುವುದನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (w/v, ಚಿತ್ರ 1c).
ಈ ಕೆಲಸದಲ್ಲಿ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಿದ ವಿವಿಧ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ರಚನೆಗಳ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯ.b ವಿವಿಧ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಗೆ (300 mg/mL) 37 °C ನಲ್ಲಿ ಜೆಲ್ ಸಮಯವು ಸೀಸೆಯನ್ನು ತಿರುಗಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.CT ಜೆಲ್ ಅನ್ನು ಕಾವು ಇಲ್ಲದೆ ತಕ್ಷಣವೇ (<300 mg/mL), 2Rep ಅವಕ್ಷೇಪಗಳು (300 mg/mL, 5 mm ಸ್ಕೇಲ್).c ಹಿಸ್-NT2RepCT ಮತ್ತು NT ಯ ಜೆಲ್ ಸಮಯ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಸೂಚಿಸಲಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ.d ಸ್ಪೈಡರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಹಿಸ್-NT2RepCT ಮತ್ತು NT ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳ ಛಾಯಾಚಿತ್ರಗಳು ಮತ್ತು "NT" ಅಕ್ಷರವನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ ಕೆಳಗೆ ಮುದ್ರಿಸಲಾಗಿದೆ (ಎರಡೂ 200 mg/mL, ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ 5 mm).
ವಿವಿಧ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ ರೂಪುಗೊಂಡ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳು ಸ್ವಲ್ಪ ವಿಭಿನ್ನ ಬಣ್ಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಬರಿಗಣ್ಣಿನ ವೀಕ್ಷಣೆಯು ವಿವಿಧ ಹಂತದ ಪಾರದರ್ಶಕತೆಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ (Fig. 1b).NT ಜೆಲ್‌ಗಳು ಅಸಾಧಾರಣವಾಗಿ ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿದ್ದರೆ ಇತರ ಜೆಲ್‌ಗಳು ಅಪಾರದರ್ಶಕವಾಗುತ್ತವೆ.ಅವನ-NT2RepCT ಮತ್ತು NT ಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ಸಿಲಿಂಡರಾಕಾರದ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಎರಕಹೊಯ್ದ ಅಚ್ಚಿನಿಂದ ಹಾಗೇ ತೆಗೆಯಬಹುದು (Fig. 1d).
ನೈಸರ್ಗಿಕ ಸ್ಪೈಡರ್ ರೇಷ್ಮೆ ಲೇಪನದ ಜೆಲ್ ಈಗ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಸ್ಪೈಡ್ರೊಯಿನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಜಿಲೇಶನ್‌ಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತಿದೆಯೇ ಎಂದು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ಸ್ವೀಡಿಷ್ ಸೇತುವೆಯ ಜೇಡದ ದೊಡ್ಡ ಆಂಪುಲ್ಲಾ ಗ್ರಂಥಿಯಿಂದ (ಲಾರಿನಿಯೊಯಿಡ್ಸ್ ಸ್ಕ್ಲೋಪೆಟೇರಿಯಸ್) ಲೇಪನಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ.ಲೇಪನಗಳನ್ನು 20 mM Tris-HCl ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 50 mg/mL ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗಿದೆ (ಅಳತೆ ಒಣ ತೂಕದ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ), ಆದರೆ 37 °C ನಲ್ಲಿ 21 ದಿನಗಳ ಕಾವು ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಜಿಲೇಶನ್ ಅನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 2a).
ಈ ಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲು, ಜಿಲೇಶನ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು ಒಟ್ಟಾರೆ ಯಾಂತ್ರಿಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ರೆಯೋಲಾಜಿಕಲ್ ಅಳತೆಗಳನ್ನು ಬಳಸಬಹುದು.ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಎತ್ತರದ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಶೇಖರಣಾ ಮಾಡ್ಯುಲಸ್ (ಸ್ಥಿತಿಸ್ಥಾಪಕತ್ವ) ಅನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡುವುದು ಜೆಲ್ಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು ಲೇಪನದ ವಿಸ್ಕೋಲಾಸ್ಟಿಕ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಒದಗಿಸುತ್ತದೆ.ತಾಪಮಾನ ಏರಿಕೆಯ ಪ್ರಯೋಗಗಳು (ನೈಸರ್ಗಿಕ ರೇಷ್ಮೆ ಸ್ಟಾಕ್ ಪರಿಹಾರಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಹಿಂದಿನ ಅಧ್ಯಯನಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ 25-45 ° C ನಲ್ಲಿ 1 ° C/ನಿಮಿಷವನ್ನು ಬಳಸುವುದು) 40,41 ಹೆಚ್ಚುತ್ತಿರುವ ತಾಪಮಾನದೊಂದಿಗೆ His-NT2RepCT ಮತ್ತು NT ದ್ರಾವಣಗಳ ಶೇಖರಣಾ ಮಾಡ್ಯೂಲಿಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ.ಹೆಚ್ಚಿಸಲಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 2 ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 3).ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, NT ಮಾಡ್ಯೂಲ್ His-NT2RepCT ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಕಡಿಮೆ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಬೆಳೆಯಲು ಪ್ರಾರಂಭಿಸಿತು, NT ನೇರವಾಗಿ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಹಿಸ್-NT2RepCT ಯೊಂದಿಗೆ ಕಾವು ಪಡೆದಾಗ ಗಮನಿಸಿದ ವೇಗವಾದ ಜೆಲ್ ಸಮಯಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 1).ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿನ ನಂತರದ ಕುಸಿತದ ನಂತರ, ಶೇಖರಣಾ ಮಾಡ್ಯುಲಸ್ ಕಡಿಮೆ ಮೌಲ್ಯಗಳಿಗೆ ಹಿಂತಿರುಗಲಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ನಷ್ಟ ಮಾಡ್ಯುಲಸ್‌ನ ಮೇಲೆ ಉಳಿಯಿತು (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 3 ನೋಡಿ), ಇದು ಉಷ್ಣವಾಗಿ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗದ ಸ್ಥಿರವಾದ ಜಿಲೇಶನ್ ಅನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಜಿಲೇಶನ್ ನಂತರ, ಅಂತಿಮ ಸ್ಥಿತಿಸ್ಥಾಪಕ ಮಾಡ್ಯುಲಸ್ 100-500 mg/mL ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ His-NT2RepCT ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳಿಗೆ 15 ರಿಂದ 330 kPa ವರೆಗೆ ಇರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು NT ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳಿಗೆ (100-500 mg/mL) ಅಂತಿಮ ಸ್ಥಿತಿಸ್ಥಾಪಕ ಮಾಡ್ಯುಲಸ್ 2 ರಿಂದ 14000 ವರೆಗೆ ಇರುತ್ತದೆ. kPa (Fig. , 2 ಮತ್ತು ಸಂಪೂರ್ಣ ರಾಂಪ್ ಡೇಟಾ) ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 3 ನೋಡಿ).
ಅಲುಗಾಡುವಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಅವನ-NT2RepCT (300 mg/mL) ಮತ್ತು b NT (300 mg/mL) ಅಳತೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆ.ಬಾಣಗಳು ತಾಪಮಾನದ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಶೇಖರಣಾ ಮಾಡ್ಯೂಲ್ ಡೇಟಾದ ಹಗುರವಾದ ಛಾಯೆಯು ತಯಾರಕರು ನಿರ್ದಿಷ್ಟಪಡಿಸಿದಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಟಾರ್ಕ್ ಮೌಲ್ಯಗಳಲ್ಲಿ ಉಪಕರಣದ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಚಿತ್ರಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಹೆಚ್ಚಿದ ಶಬ್ದಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗಿದೆ.c ಎತ್ತರದ ತಾಪಮಾನ (100, 300, ಮತ್ತು 500 mg/mL) ನಂತರ His-NT2RepCT ಮತ್ತು NT ಯ ಅಂತ್ಯ-ಮಾಡ್ಯೂಲ್ ಶೇಖರಣೆ.ಎಲ್ಲಾ ಮಾಡ್ಯೂಲ್ ವಾಚನಗೋಷ್ಠಿಯನ್ನು 0.1 Hz ಆವರ್ತನದಲ್ಲಿ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಜಿಲೇಶನ್‌ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡುವ ಸಂಭಾವ್ಯ ವಿಧಾನವಾಗಿ, ನಾವು 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಹಿಸ್-ಎನ್‌ಟಿ 2 ರೆಪ್‌ಸಿಟಿ ಮತ್ತು ಎನ್‌ಟಿಯ ಎಫ್‌ಟಿಐಆರ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವನ್ನು ಜಿಲೇಶನ್ ಮೊದಲು ಮತ್ತು ನಂತರ ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 3 ಎ, ಬಿ).ನಿರೀಕ್ಷಿಸಿದಂತೆ, His-NT2RepCT ಮತ್ತು NT ಪರಿಹಾರಗಳ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವು α-ಹೆಲಿಕ್ಸ್/ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಸುರುಳಿಯ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಯನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಅನುರೂಪವಾಗಿದೆ, 1645 cm-1 ನಲ್ಲಿ ಉಚ್ಚರಿಸಲಾದ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ನೊಂದಿಗೆ.ಎರಡೂ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳಿಗೆ, ಜಿಲೇಶನ್ ಮಧ್ಯದ I ಬ್ಯಾಂಡ್‌ನಲ್ಲಿ ಸುಮಾರು 1617 cm-1 ಮತ್ತು 1695 cm-1 (Fig. 3a, b) ನಲ್ಲಿ ಎರಡು ತೋಳುಗಳ ರಚನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಯಿತು, ಇದು ಆಂಟಿಪ್ಯಾರಲಲ್ β-ಶೀಟ್ ರಚನೆಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಈ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಆಯಾ ಎರಡನೇ ವ್ಯುತ್ಪನ್ನ ಮತ್ತು ವ್ಯತ್ಯಾಸದ ಜಿಲೇಶನ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾದಲ್ಲಿ ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ ಕಾಣಬಹುದು (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 4b).NT β-ಪದರದ ಎರಡು ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು His-NT2RepCT ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಉಚ್ಚರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿವೆ, NT ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ನಲ್ಲಿನ β-ಪದರದ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳ ಒಟ್ಟು ವಿಷಯವು NT2RepCT ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನದಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಹಿಸ್-ಎನ್‌ಟಿ 2 ರೆಪ್‌ಸಿಟಿ ಮತ್ತು ಬಿ ಎನ್‌ಟಿ (ಎರಡೂ 500 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಎಂಎಲ್) ಯ FTIR ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ (ಪರಿಹಾರ) ಮತ್ತು ನಂತರ (ಜೆಲ್) 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವು.c TEM ಚಿತ್ರಗಳು ಮರುಕಳಿಸಿದ 50 mg/ml NT2RepCT ಜೆಲ್‌ಗಳು ಮತ್ತು d NT.ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ 200 nm.ಅವರ-NT2RepCT ಮತ್ತು NT ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳ ಇ ಫೈಬರ್ ವ್ಯಾಸಗಳು.n = 100 ಅಳತೆಯ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳು, p <0.0001.ದೋಷ ಪಟ್ಟಿಗಳು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.ದೋಷ ಬಾರ್‌ಗಳ ಮಧ್ಯಭಾಗವು ಸರಾಸರಿಯಾಗಿದೆ.ಸಂಖ್ಯಾಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಜೋಡಿಯಾಗದ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು (ಎರಡು-ಬಾಲದ) ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.f 37 °C ನಲ್ಲಿ ಅಲುಗಾಡದೆ ವಿವಿಧ ರಿಕಾಂಬಿನಂಟ್ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳ (100 mg/mL) ThT ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್.0%, 5%, 10%, ಮತ್ತು 20% ಬೀಜಗಳೊಂದಿಗೆ 100 mg/mL NT ಜೆಲ್‌ನಿಂದ g NT (100 mg/mL) ಇನಾಕ್ಯುಲೇಷನ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳು.
ಟ್ರಾನ್ಸ್ಮಿಷನ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (TEM) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಜೆಲ್ನ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ತರಹದ ಫೈಬ್ರಿಲ್ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (Fig. 3c, 3d).NT-ರೂಪುಗೊಂಡ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳು ಉದ್ದವಾದವು (5-12 nm ವ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ) ಮತ್ತು ಕವಲೊಡೆದವು, ಆದರೆ ಅವರ-NT2RepCT ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳು ಉದ್ದದಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ಮತ್ತು ವ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ (7-16 nm) ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಅಗಲವಾಗಿರುತ್ತವೆ (Fig. 3e).ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಥಿಯೋಫ್ಲಾವಿನ್ T (ThT) ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಫೈಬ್ರೋಸಿಸ್ನ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಅನುಸರಿಸಲು ನಮಗೆ ಅವಕಾಶ ಮಾಡಿಕೊಟ್ಟವು.ಎಲ್ಲಾ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಗೆ, ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 37 °C ನಲ್ಲಿ ಕಾವು ಮಾಡಿದಾಗ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಕೇತವು ಹೆಚ್ಚಾಯಿತು (Fig. 3f, ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 5a).ಈ ಅನ್ವೇಷಣೆಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, ಜೆಲ್ಲಿಂಗ್ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ NT ಮತ್ತು His-NT2RepCT ಯ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕೀಯ ಪರೀಕ್ಷೆಯು ThT-ಪಾಸಿಟಿವ್ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳ ಗಮನಾರ್ಹ ಸ್ಥಳೀಯ ಶೇಖರಣೆಯಿಲ್ಲದೆ ThT ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಏಕರೂಪದ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ. 5b,c).ThT-ಪಾಸಿಟಿವ್ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳ ರಚನೆಯು ಎನ್‌ಟಿ ಮತ್ತು ಹಿಸ್-ಎನ್‌ಟಿಸಿಟಿ ಟರ್ಬಿಡಿಟಿ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗರ್ 5 ಡಿ) ಹೆಚ್ಚಳದೊಂದಿಗೆ ಇರಲಿಲ್ಲ, ಅಂದರೆ ಜೆಲ್‌ನಲ್ಲಿನ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್ ಜೆಲ್ ಸ್ಪಷ್ಟತೆಗೆ ಧಕ್ಕೆಯಾಗದಂತೆ ರಚಿಸಬಹುದು.ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಮೊದಲೇ ರೂಪುಗೊಂಡ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೂಲಕ ಬಿತ್ತನೆಯು ಕೆಲವು ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್‌ಗಳ ಫೈಬ್ರಿಲ್ ರಚನೆಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ವೇಗಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ42,43,44 ಆದರೆ 5%, 10% ಅಥವಾ 20% (w/w) NT ಯನ್ನು NT ಹೈಡ್ರೊಕೋಗ್ಯುಲಂಟ್‌ಗಳ ದ್ರಾವಣಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸುತ್ತದೆ.ಬಿತ್ತನೆ ಪರಿಣಾಮ (ಚಿತ್ರ 3g).ಬಹುಶಃ ಇದು ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ನಲ್ಲಿನ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳು ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಬೀಜಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಎಂಬ ಅಂಶದಿಂದಾಗಿರಬಹುದು.
ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಅನಿರೀಕ್ಷಿತ ನಡವಳಿಕೆಯು ಜೆಲ್ ರಚನೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಮ್ಯಾಗ್ನೆಟಿಕ್ ರೆಸೋನೆನ್ಸ್ (NMR) ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ಅಧ್ಯಯನಗಳನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಿತು.37 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ ದಾಖಲಿಸಲಾದ His-NT2RepCT ಪರಿಹಾರಗಳ NMR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವು CT ಇನ್ನೂ ಭಾಗಶಃ ಮಡಚಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ, ಆದರೆ NT ಮತ್ತು 2Rep ಸಂಕೇತಗಳು ಕಣ್ಮರೆಯಾಗಿವೆ (Fig. 4a), ಇದು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ NT ಮತ್ತು 2Rep ರಚನೆಯನ್ನು ಭಾಗಶಃ ನಿಯಂತ್ರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. NT2RepCT ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್.CT ಸಿಗ್ನಲ್ ಅನ್ನು ಅದರ ಮೂಲ ತೀವ್ರತೆಯ 20% ರಷ್ಟು ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, CT ಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್ ರಚನೆಯಲ್ಲಿ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.CT ಯ ಒಂದು ಚಿಕ್ಕ ಭಾಗಕ್ಕೆ, ಇದು ಪೂರ್ವನಿಯೋಜಿತ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿರುವಂತೆ ಚಲನಶೀಲವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು NMR ಪರಿಹಾರದಿಂದ ಗಮನಿಸಲ್ಪಡುತ್ತದೆ, ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವು ಮೊದಲ 10 ರಚನಾತ್ಮಕ ಅವಶೇಷಗಳಿಗೆ ಸಂಕೇತಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದಿಲ್ಲ, ಬಹುಶಃ His-NT2Rep ನ ಲಗತ್ತಿಸಲಾದ ಭಾಗದ ಕಷ್ಟಕರವಾದ ನಿಶ್ಚಲತೆಯಿಂದಾಗಿ.-ಸ್ಟೇಟ್ ಆಫ್ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳ NMR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ -NT2RepCT α-ಹೆಲಿಕ್ಸ್ ಮತ್ತು β-ಲೇಯರ್‌ಗಳ ಪ್ರಧಾನ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿತು ಮತ್ತು ಸ್ವಲ್ಪ ಮಟ್ಟಿಗೆ, ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಸುರುಳಿಯ ರಚನೆ (Fig. 4b).NT ಯಲ್ಲಿ ಮಾತ್ರ ಇರುವ ಮೆಥಿಯೋನಿನ್ ಅವಶೇಷಗಳ ರಾಸಾಯನಿಕ ಬದಲಾವಣೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಈ ಡೊಮೇನ್ ಅನ್ನು β-ಶೀಟ್ ರಚನೆಯಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ.ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ NT ಯ ಸಮಯ-ಅವಲಂಬಿತ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ ಸಿಗ್ನಲ್ ತೀವ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಏಕರೂಪದ ಇಳಿಕೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (Fig. 4c), ಮತ್ತು NT ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳ ಘನ-ಸ್ಥಿತಿಯ NMR ಹೆಚ್ಚಿನ NT ಶೇಷಗಳನ್ನು β-ಶೀಟ್ ರಚನೆಗಳಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (Fig. 4d).ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯಿಂದಾಗಿ 2Rep ನ ಅನುಸರಣೆಯನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗಲಿಲ್ಲ.ಆದಾಗ್ಯೂ, NTCT ಮತ್ತು His-NT2RepCT ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳ ಘನ ಸ್ಥಿತಿಯ NMR ವರ್ಣಪಟಲವು ತುಂಬಾ ಹೋಲುತ್ತದೆ (Fig. 4b; ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ. 6b), 2Rep ಅವನ-NT2RepCT ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ನ ರಚನಾತ್ಮಕ ಭಾಗಕ್ಕೆ ಸ್ವಲ್ಪ ಕೊಡುಗೆ ನೀಡಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.CT ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳಿಗೆ, α-ಹೆಲಿಕ್ಸ್, β-ಶೀಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಸುರುಳಿಯಾಕಾರದ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಗಳು ಅಸ್ತಿತ್ವದಲ್ಲಿವೆ ಎಂದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗ್. 6d).ಇದು CT ಯ ಕೆಲವು ಭಾಗಗಳು α-ಹೆಲಿಸ್‌ಗಳಾಗಿ ಉಳಿದಿದ್ದರೆ ಇತರವುಗಳು β-ಶೀಟ್‌ಗಳಾಗುತ್ತವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಹೀಗಾಗಿ, NMR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್ ರಚನೆಗೆ NT ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 2Rep ಮತ್ತು CT ನೊಂದಿಗೆ ಸಮ್ಮಿಳನದ ಮೇಲೆ β-ಶೀಟ್ ರಚನೆಯಾಗಿ ರೂಪಾಂತರಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಇದಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿ, NT ಡೊಮೇನ್‌ನ ಎಲ್ಲಾ ಐದು ಹೆಲಿಸ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ಝಿಪ್ಪರ್‌ಗಳು ರೂಪುಗೊಳ್ಳುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ವಾಲ್ಟ್ಜ್ ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್ ಹೆಲಿಕ್ಸ್ 1 (Fig. 4e) ನಲ್ಲಿ ಅಮಿಲೋಡೋಜೆನಿಕ್ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಊಹಿಸಿದೆ.
2D ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT ಪರಿಹಾರ ಮೊದಲು (ನೀಲಿ) ಮತ್ತು 19 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾವು ನಂತರ (ಕೆಂಪು) 37 ° C ನಲ್ಲಿ.ಕೆಂಪು ವರ್ಣಪಟಲದಲ್ಲಿ ವೈಯಕ್ತಿಕ ಅಡ್ಡ ಶಿಖರಗಳು ಮತ್ತು ನೀಲಿ ವರ್ಣಪಟಲದಲ್ಲಿ F24, G136, polyA ಗಳನ್ನು ಒಂದೇ ಅಕ್ಷರದ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲ ಚಿಹ್ನೆಗಳು ಮತ್ತು ಶೇಷ ಸಂಖ್ಯೆಗಳಿಂದ ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.NT, 2Rep ಮತ್ತು CT ಡೊಮೇನ್‌ಗಳಿಂದ ಆಯ್ದ ಶೇಷಗಳಿಗೆ ಸಮಯಕ್ಕೆ ಸಿಗ್ನಲ್ ತೀವ್ರತೆಯ ಅವಲಂಬನೆಯನ್ನು ಇನ್‌ಸೆಟ್‌ಗಳು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.b ಘನ-ಸ್ಥಿತಿಯ ರೇಡಿಯೊಫ್ರೀಕ್ವೆನ್ಸಿ (RFDR) ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ ಅವರ-NT2RepCT ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳು.RFDR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾದಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಲಾದ Cα/Cβ ಅವಶೇಷಗಳ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧಗಳನ್ನು ಮಾದರಿ ಪೆಪ್ಟೈಡ್ ರಾಸಾಯನಿಕ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಮತ್ತು ಅಂಕಿಅಂಶಗಳು 82,83 ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಗಳಿಂದ ಪಡೆದ ಮೌಲ್ಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸುವ ಮೂಲಕ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.SSB - ತಿರುಗುವ ಸೈಡ್‌ಬ್ಯಾಂಡ್.c 36 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ 37 °C ನಲ್ಲಿ ಕಾವು ಸಮಯದಲ್ಲಿ 15N-HSQC 10 mg/mL NT ದ್ರಾವಣದ ಒಂದು ಆಯಾಮದ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ.ಇನ್ಸೆಟ್ ಸಮಯ ಮತ್ತು ಪರಿಮಾಣದ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.d NT ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳ ಘನ ಸ್ಥಿತಿ RFDR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ.RFDR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾದಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಲಾದ Cα/Cβ ಅವಶೇಷಗಳು ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆಗಳ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಇ Zipper ಡೇಟಾಬೇಸ್‌ನಿಂದ NT45.79 ಕಂಪನ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯ ಪ್ರೊಫೈಲ್ ಅನ್ನು ಆಧರಿಸಿದೆ (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).ಹೆಕ್ಸಾಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ನ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ಮಿಂಚಿನ ಶಿಫ್ಟ್ ವಿಂಡೋದ ರೊಸೆಟ್ಟಾ ಶಕ್ತಿಯನ್ನು kcal/mol ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಕೆಂಪು ಪಟ್ಟಿಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ಫೈಬ್ರೋಸಿಸ್ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯೊಂದಿಗೆ ಹೆಕ್ಸಾಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ (ರೊಸೆಟ್ಟಾ ಶಕ್ತಿ -23 kcal/mol ಕೆಳಗೆ; ಚುಕ್ಕೆಗಳ ರೇಖೆಯ ಕೆಳಗೆ).ಹಸಿರು ಬಾರ್‌ಗಳು ಮಿತಿಗಿಂತ ಮೇಲಿರುವ ರೋಸೆಟ್ಟಾ ಶಕ್ತಿಗಳೊಂದಿಗೆ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ಸ್ಟೆರಿಕ್ ಝಿಪ್ಪರ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುವ ಸಾಧ್ಯತೆ ಕಡಿಮೆ.ಪ್ರೋಲಿನ್ ಹೊಂದಿರುವ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಹೊರಗಿಡಲಾಗಿದೆ (ಕಾಲಮ್‌ಗಳಿಲ್ಲದೆ).ವಾಲ್ಟ್ಜ್ ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್ 81 (https://waltz.switchlab.org) ಮೂಲಕ ಊಹಿಸಲಾದ ಅಮಿಲೋಯ್ಡೋಸಿಸ್ನ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಚೌಕಗಳು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.NT ಯ ಅಮೈನೋ ಆಮ್ಲದ ಅವಶೇಷಗಳ ಅನುಕ್ರಮವು ಮೇಲ್ಭಾಗದಲ್ಲಿದೆ ಮತ್ತು β ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಅವಶೇಷಗಳ ಪ್ರಕಾರಗಳನ್ನು (ಘನ-ಸ್ಥಿತಿಯ NMR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಯಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ) ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಐದು NT α-ಹೆಲಿಸ್‌ಗಳ ಸ್ಥಾನಗಳನ್ನು (H1-H5)28 ಎಂದು ಗೊತ್ತುಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ.
pH <6.5 ನಲ್ಲಿ, HT ಡೈಮರೈಸ್ ಆಗುತ್ತದೆ, ಶಾಖ ಅಥವಾ ಯೂರಿಯಾ-ಪ್ರೇರಿತ ಡಿನಾಟರೇಶನ್‌ಗೆ ನಿರೋಧಕವಾಗಿದೆ.NT ಡೈಮರೈಸೇಶನ್ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರತೆಯು ಜಿಲೇಶನ್ ಮೇಲೆ ಹೇಗೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ವಿವರಿಸಲು, 100 mg/ml NT ಹೊಂದಿರುವ ದ್ರಾವಣಗಳನ್ನು pH 8, 7, ಮತ್ತು 6 ರಲ್ಲಿ ಸೀಸೆ ವಿಲೋಮ ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.NT ಮಾದರಿಗಳು pH 8 ಮತ್ತು 7 ನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ 37 °C ನಲ್ಲಿ ಜೆಲ್ ಆಗಿವೆ, ಆದರೆ pH 8 ಜೆಲ್ ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ ಉಳಿಯಿತು, ಆದರೆ pH 7 ಜೆಲ್ ಗೋಚರ ಅವಕ್ಷೇಪವನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ (Fig. 5a).ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, pH 6 ನಲ್ಲಿ HT ಹೊಂದಿರುವ ದ್ರಾವಣವು ಜೆಲ್ ಅನ್ನು ರೂಪಿಸಲಿಲ್ಲ ಮತ್ತು 37 ° C ನಲ್ಲಿ 20 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ ದೊಡ್ಡ ಅವಕ್ಷೇಪವನ್ನು ಕಾಣಬಹುದು.ಮೊನೊಮರ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಡೈಮರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಅವುಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸ್ಥಿರತೆಯು ಜಿಲೇಶನ್ ಅನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ ಎಂದು ಇದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.NT 200 mg/ml27 ನಲ್ಲಿ ಕರಗುತ್ತದೆ, ಶಾಖದ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ನಂತರ ಸುಲಭವಾಗಿ ಮರುಕಳಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಮೌಲ್ಯಗಳಲ್ಲಿ α-ಹೆಲಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ ಎಂದು ವರದಿ ಮಾಡಿರುವುದರಿಂದ pH 7 ಮತ್ತು 6 ನಲ್ಲಿ NT ಗಾಗಿ ಅವಕ್ಷೇಪನ ರಚನೆಯು ನಿರೀಕ್ಷಿಸಿರಲಿಲ್ಲ. pH 18. ಈ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳಿಗೆ ಸಂಭವನೀಯ ವಿವರಣೆಯೆಂದರೆ, ಈ ಹಿಂದೆ ವರದಿ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
37 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವು ನಂತರ pH 8, 7, 6 ಮತ್ತು 154 mM NaCl (pH 8) ನಲ್ಲಿ NT ಸೀಸೆ ವಿಲೋಮ ಪರೀಕ್ಷೆ (100 mg/mL).b NT CD ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ 154 mM NaF ಮತ್ತು 154 mM NaCl ಜೊತೆಗೆ ಮತ್ತು ಇಲ್ಲದೆ.222 nm ನಲ್ಲಿ ಮೋಲಾರ್ ದೀರ್ಘವೃತ್ತವನ್ನು ನೈಸರ್ಗಿಕ ಮಡಿಕೆಗಳ ಅನುಪಾತಕ್ಕೆ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.c NT ವಿಲೋಮ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (100 mg/mL) NT* (37 °C ಮತ್ತು 60 °C), NTA72R (37 °C), ಮತ್ತು His-NT-L6 (37 °C ಮತ್ತು 60 °C).NT ಮ್ಯುಟೆಂಟ್ಸ್ NT*, NTA72R, ಮತ್ತು His-NT-L6 ನ d CD ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ.222 nm ನಲ್ಲಿ ಮೋಲಾರ್ ದೀರ್ಘವೃತ್ತವನ್ನು ನೈಸರ್ಗಿಕ ಮಡಿಕೆಗಳ ಅನುಪಾತಕ್ಕೆ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.e NTFlSp, NTMiSp ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆಯಾದ NTMiSp (100 mg/mL) ನ ವಿಲೋಮ ಪರೀಕ್ಷೆ.ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ 5 ಮಿಮೀ.NT, NTFlSp, NTMiSp ನ f CD ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆಯಾದ NTMiSp.222 nm ನಲ್ಲಿ ಮೋಲಾರ್ ದೀರ್ಘವೃತ್ತವನ್ನು ನೈಸರ್ಗಿಕ ಮಡಿಕೆಗಳ ಅನುಪಾತಕ್ಕೆ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.25 °C ಮತ್ತು 95 °C ನಲ್ಲಿ ಪೂರ್ಣ NT ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವನ್ನು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 8 ರಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಶಾರೀರಿಕ ಉಪ್ಪಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯು NT ಉಪಘಟಕಗಳ ನಡುವಿನ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಸಂವಹನಗಳನ್ನು ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ pH18 ಗೆ NT ವರ್ಗಾವಣೆಯ ಡೈಮರೈಸೇಶನ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುತ್ತದೆ.154 mM NaCl ಮತ್ತು NaF ನ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯು ಕ್ರಮವಾಗಿ ಜಿಲೇಶನ್ ಅನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (Fig. 5a, b; ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 2b) ಮತ್ತು ಈ ಲವಣಗಳು NT ಮಾನೋಮರ್‌ಗಳ ಉಷ್ಣ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿವೆ (Fig. 5b, ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 8) .ಡೈಮರೈಸೇಶನ್ ಬದಲಿಗೆ ಸ್ಥಿರತೆಯ ವರ್ಧನೆಯು ಜೆಲ್ ರಚನೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ ಎಂದು ಇದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ಜಿಲೇಶನ್‌ನಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಡೈಮರೈಸೇಶನ್ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರತೆಯ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಅನ್ವೇಷಿಸಲು, ನಾವು ಎರಡು ರೂಪಾಂತರಿತ ರೂಪಾಂತರಗಳನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ, NT* ಮತ್ತು NTA72R, ಇದು ಕಡಿಮೆ pH28.30 ನಲ್ಲಿ ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ ಆಗಿ ಉಳಿಯುತ್ತದೆ.NT* ಒಂದು ಡಬಲ್ ಚಾರ್ಜ್ ರಿವರ್ಸಲ್ ಮ್ಯುಟೆಂಟ್ ಆಗಿದ್ದು, ಇದರಲ್ಲಿ ಮೊನೊಮರ್‌ನ ಸ್ಪಷ್ಟ ದ್ವಿಧ್ರುವಿ ಚಾರ್ಜ್ ವಿತರಣೆಯು ಚಪ್ಪಟೆಯಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಇದು ಡೈಮರೈಸೇಶನ್ ಅನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮೊನೊಮರ್ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ತೀವ್ರವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ.NTA72R ಚಾರ್ಜ್ಡ್ ದ್ವಿಧ್ರುವಿಯಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಆರ್ಗ್-ಬದಲಿಯಾಗಿರುವ ಅಲಾ ಡೈಮರ್ ಗಡಿಯಲ್ಲಿದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ರೂಪಾಂತರಗಳು ಡೈಮರೈಸೇಶನ್‌ಗೆ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಉಪಘಟಕ ಸಂವಹನಗಳೊಂದಿಗೆ ಮಧ್ಯಪ್ರವೇಶಿಸುತ್ತವೆ.37°C ನಲ್ಲಿ ಕಾವು ಕೊಟ್ಟಾಗ, NT* ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್ ಅನ್ನು ರೂಪಿಸಲಿಲ್ಲ, ಆದರೆ NTA72R 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಅಪಾರದರ್ಶಕ ಜೆಲ್ ಅನ್ನು ರಚಿಸಿತು (Fig. 5c).NT* ಮತ್ತು NTA72R ಎರಡೂ ಡೈಮರೈಸ್ ಮಾಡಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ ಆದರೆ ಮೊನೊಮರ್ ಸ್ಥಿರತೆಯಲ್ಲಿ ಭಿನ್ನವಾಗಿರುತ್ತವೆ (Fig. 5d), ಹೆಚ್ಚಿನ ಥರ್ಮೋಡೈನಾಮಿಕ್ ಸ್ಥಿರತೆಯು NT ಯನ್ನು ಜೆಲ್ಲಿಂಗ್‌ನಿಂದ ತಡೆಯುತ್ತದೆ ಎಂದು ಈ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಬಲವಾಗಿ ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ (60 ° C ನಲ್ಲಿ 8 ನಿಮಿಷಗಳ ನಂತರ; ಚಿತ್ರ 5c) ಅಸ್ಥಿರವಾದಾಗ HT* ಜೆಲ್ ಅನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬ ಅಂಶದಿಂದ ಇದು ಬೆಂಬಲಿತವಾಗಿದೆ.NT ಯಲ್ಲಿನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮೆಥಿಯೋನಿನ್ ಅಂಶವು ಅದರ ನೈಸರ್ಗಿಕ ಮಡಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ದ್ರವೀಕರಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆರು Met to Leu ಬದಲಿಗಳು (ಇಲ್ಲಿ ಹಿಸ್-NT-L6 ಎಂದು ಉಲ್ಲೇಖಿಸಲಾಗಿದೆ) NT46 ಮಾನೋಮರ್ ಅನ್ನು ಬಲವಾಗಿ ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಹಿಂದೆ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.NT ಜೆಲ್ ರಚನೆಗೆ ರಚನಾತ್ಮಕ ನಮ್ಯತೆಯ ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಎಂಬ ಊಹೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ, ಹಿಸ್-NT-L6 ಸ್ಥಿರ ರೂಪಾಂತರವು 37 °C ನಲ್ಲಿ ಜೆಲ್ ಆಗಿಲ್ಲ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 5c, d).ಆದಾಗ್ಯೂ, His-NT-L6 ಸಹ 60 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 60 ° С ನಲ್ಲಿ ಕಾವು ಮಾಡಿದ ಮೇಲೆ ಜೆಲ್ ಅನ್ನು ರಚಿಸಿತು (Fig. 5c).
β-ಶೀಟ್ ರಚನೆಗಳಾಗಿ ರೂಪಾಂತರಗೊಳ್ಳಲು ಮತ್ತು ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸಲು NT ಯ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವು ಕೆಲವು ಸ್ಪೈಡ್ರೊಯಿನ್‌ನ ಎಲ್ಲಾ NT ಡೊಮೇನ್‌ಗಳಿಗೆ ಅನ್ವಯಿಸುವುದಿಲ್ಲ.ವಿಭಿನ್ನ ರೇಷ್ಮೆ ಪ್ರಕಾರಗಳು ಮತ್ತು ಜೇಡ ಪ್ರಭೇದಗಳ NTಗಳು, ಟ್ರೈಕೊನೆಫಿಲಾ ಕ್ಲಾವಿಪ್ಸ್ (NTFlSp), ಅವುಗಳ ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮೆಥಿಯೋನಿನ್ ಅಂಶ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಉಷ್ಣ ಸ್ಥಿರತೆಯ ಹೊರತಾಗಿಯೂ ಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ರಚಿಸಿದವು (Fig. 5e, f ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 2).ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, ಕಡಿಮೆ ಉಷ್ಣ ಸ್ಥಿರತೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಮೆಥಿಯೋನಿನ್ ಅಂಶದೊಂದಿಗೆ ಅರೇನಿಯಸ್ ವೆಂಟ್ರಿಕೋಸಸ್ (NTMiSp) ನಿಂದ ಸಣ್ಣ ಆಂಪ್ಯುಲರ್ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಸ್ಪೈಡ್ರೊಯಿನ್‌ನಿಂದ NT ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸಲಿಲ್ಲ (ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 2 ಮತ್ತು Fig. 5e, f).ಎರಡನೆಯದು ಇಂಟ್ರಾಮೋಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಡೈಸಲ್ಫೈಡ್ ಬಂಧಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿರಬಹುದು29,47.ಸ್ಥಿರವಾಗಿ, NTMiSp ನ ಡೈಸಲ್ಫೈಡ್ ಬಂಧಗಳು ಕಡಿಮೆಯಾದಾಗ, ಅದು 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವು ನಂತರ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್ ಅನ್ನು ರಚಿಸಿತು (Fig. 5e).ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ, NT ಯಿಂದ ಜೆಲ್ ರಚನೆಗೆ ರಚನಾತ್ಮಕ ನಮ್ಯತೆಯು ಒಂದು ಪ್ರಮುಖ, ಆದರೆ ಏಕೈಕ ಮಾನದಂಡವಲ್ಲ ಎಂದು ಗಮನಿಸಬೇಕು.ಸಂಬಂಧಿಸಬಹುದಾದ ಮತ್ತೊಂದು ಅಂಶವೆಂದರೆ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುವ ಒಲವು, ಮತ್ತು ಝಿಪ್ಪರ್ ಡೇಟಾಬೇಸ್ ಮತ್ತು ವಾಲ್ಟ್ಜ್ ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್‌ನೊಂದಿಗಿನ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯ ಮತ್ತು ಅಮಿಲೋಯ್ಡೋಜೆನಿಕ್ ಪ್ರದೇಶಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ತೋರಿಸಿದೆ, ಹಾಗೆಯೇ ಪ್ರದೇಶಗಳ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯನ್ನು ಊಹಿಸಲಾಗಿದೆ. ಸ್ಟೆರಿಕ್ ಝಿಪ್ಪರ್ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸಲು.ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವಿತ್ತು (ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 2 ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 9).
NT ಯ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವು ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಮತ್ತು ಅನುಕೂಲಕರ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಇತರ ಪ್ರೋಟೀನ್ ತುಣುಕುಗಳೊಂದಿಗೆ NT ಸಮ್ಮಿಳನಗಳು ಇನ್ನೂ ಸಮ್ಮಿಳನ ಪಾಲುದಾರರ ಪೂರ್ಣ ಕಾರ್ಯದೊಂದಿಗೆ ಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸಬಹುದು ಎಂದು ಊಹಿಸಲು ಕಾರಣವಾಯಿತು.ಇದನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ನಾವು ಹಸಿರು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ (GFP) ಮತ್ತು ಪ್ಯೂರಿನ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಸೈಡ್ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಸ್ (PNP) ಅನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ NT ಯ C-ಟರ್ಮಿನಸ್‌ನಲ್ಲಿ ಪರಿಚಯಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು E. ಕೊಲಿಯಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಅಂತಿಮ ಇಳುವರಿಯೊಂದಿಗೆ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲ್ಪಟ್ಟವು (150 mg/L ಮತ್ತು 256 mg/L ಶೇಕ್ ಫ್ಲಾಸ್ಕ್ ಸಂಸ್ಕೃತಿಗಳು ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ ಹಿಸ್-NT-GFP ಮತ್ತು His-NT-PNP), ತೋರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದ್ದಕ್ಕೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತವೆ. NT Ref ಗೆ ಬೆಸೆಯಲಾದ ಇತರ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಗೆ.30. His-NT-GFP (300mg/mL) ಮತ್ತು His-NT-PNP (100mg/mL) ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು 2 ಗಂಟೆಗಳು ಮತ್ತು 6.5 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ರಚಿಸಿದವು ಮತ್ತು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ, GFP ಭಾಗವು ಬದಲಾಗದೆ ಉಳಿಯಿತು.ಜಿಲೇಶನ್ ನಂತರ ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ, ಜಿಲೇಶನ್ ನಂತರ ಉಳಿದಿರುವ ಆರಂಭಿಕ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತೀವ್ರತೆಯ 70% (Fig. 6a).ಅವರ-NT-PNP ಪರಿಹಾರಗಳು ಮತ್ತು ಜೆಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ PNP ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಲು, ನಾವು NT ನೊಂದಿಗೆ ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಬೇಕಾಗಿತ್ತು ಏಕೆಂದರೆ ಶುದ್ಧ ತಯಾರಿಕೆಯ ಕಿಣ್ವಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯು ಜೆಲ್ಲಿಂಗ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪತ್ತೆ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯಿಂದ ಹೊರಗಿದೆ.0.01 mg/mL His-NT-PNP ಮತ್ತು 100 mg/mL NT ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಮಿಶ್ರಣದೊಂದಿಗೆ ರೂಪುಗೊಂಡ ಜೆಲ್ ಪೂರ್ವನಿಯೋಜಿತ ಮಾದರಿಗಳ ಆರಂಭಿಕ ಕಿಣ್ವಕ ಚಟುವಟಿಕೆಯ 65% ಅನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಂಡಿದೆ (Fig. 6b).ಮಾಪನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಜೆಲ್ ಹಾಗೇ ಉಳಿಯಿತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 10).
ಹಿಸ್-ಎನ್‌ಟಿ-ಜಿಎಫ್‌ಪಿ (300 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಎಂಎಲ್) ಮತ್ತು ಗೋಚರ ಮತ್ತು ಯುವಿ ಬೆಳಕಿನ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಹಿಸ್-ಎನ್‌ಟಿ-ಜಿಎಫ್‌ಪಿ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್ (300 ಮಿಗ್ರಾಂ/ಎಂಎಲ್) ಹೊಂದಿರುವ ತಲೆಕೆಳಗಾದ ಸೀಸೆಯ ಮೊದಲು ಮತ್ತು ನಂತರದ ಸಾಪೇಕ್ಷ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತೀವ್ರತೆ.ಅಂಕಗಳು ವೈಯಕ್ತಿಕ ಅಳತೆಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ (n = 3), ದೋಷ ಬಾರ್ಗಳು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.ದೋಷ ಬಾರ್‌ಗಳ ಮಧ್ಯದಲ್ಲಿ ಸರಾಸರಿ ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.b PNP ಚಟುವಟಿಕೆಯು NT (100 mg/ml) ಮತ್ತು 0.01 mg/ml his-NT-PNP ಮತ್ತು 100 mg/ml ನ್ಯೂ ತೈವಾನ್ ಡಾಲರ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ದ್ರಾವಣಗಳು ಮತ್ತು ಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಫ್ಲೋರೋಮೆಟ್ರಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.ಇನ್ಸೆಟ್ ಹಿಸ್-ಎನ್ಟಿ-ಪಿಎನ್ಪಿ (5 ಎಂಎಂ ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್) ಹೊಂದಿರುವ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ತಲೆಕೆಳಗಾದ ಸೀಸೆಯನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.
ಇಲ್ಲಿ, 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ NT ಮತ್ತು ಇತರ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ನಾವು ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ (ಚಿತ್ರ 1).α-ಹೆಲಿಸ್‌ಗಳನ್ನು β-ಪದರಗಳಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸುವುದರೊಂದಿಗೆ ಮತ್ತು ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ತರಹದ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳ ರಚನೆಯೊಂದಿಗೆ ಜಿಲೇಶನ್ ಸಂಬಂಧಿಸಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ (ಅಂಜೂರ. 3 ಮತ್ತು 4).ಎನ್‌ಟಿಗಳು ಸುರುಳಿಯಾಕಾರದ ಗೋಳಾಕಾರದ ಐದು-ಹೆಲಿಕ್ಸ್ ಬಂಡಲ್‌ಗಳಾಗಿದ್ದು, ಅವುಗಳ ಅತ್ಯಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಕರಗುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸ್ಥಿರತೆಗೆ>200 mg/mL ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ 4 ° C ನಲ್ಲಿ ಹಲವಾರು ದಿನಗಳವರೆಗೆ [27] ಈ ಸಂಶೋಧನೆಯು ಆಶ್ಚರ್ಯಕರವಾಗಿದೆ.ಜೊತೆಗೆ, NT ಗಳು µM ನಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ ಶಾಖದ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ನಂತರ ಸುಲಭವಾಗಿ ಮರುರೂಪಗೊಳ್ಳುತ್ತವೆ.ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಪ್ರಕಾರ, ಫೈಬ್ರಿಲ್ ರಚನೆಗೆ >10 mg/mL ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಸ್ವಲ್ಪ ಎತ್ತರದ ತಾಪಮಾನ (Fig. 1) ಸಂಯೋಜನೆಯ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಶಾರೀರಿಕ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಉಷ್ಣ ಏರಿಳಿತಗಳಿಂದಾಗಿ ಭಾಗಶಃ ತೆರೆದ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಇರುವ ಗೋಳಾಕಾರದ ಮಡಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳು ರೂಪುಗೊಳ್ಳಬಹುದು ಎಂಬ ಕಲ್ಪನೆಗೆ ಇದು ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ.ಈ ಪರಿವರ್ತನೆಗೆ ಒಳಗಾಗುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಉದಾಹರಣೆಗಳಲ್ಲಿ ಇನ್ಸುಲಿನ್ 49,50, β2-ಮೈಕ್ರೊಗ್ಲೋಬ್ಯುಲಿನ್, ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಥೈರೆಟಿನ್ ಮತ್ತು ಲೈಸೋಜೈಮ್51,52,53 ಸೇರಿವೆ.NT ತನ್ನ ಸ್ಥಳೀಯ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ α-ಹೆಲಿಕ್ಸ್ ಆಗಿದ್ದರೂ, ಪಾಲಿಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಸರಪಳಿಯ ಸರಿಸುಮಾರು 65% ಸ್ಟೆರಿಕ್ ಝಿಪ್ಪರ್ ರಚನೆಯೊಂದಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ (Fig. 4e) 45 .ಮೊನೊಮರ್ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಮೊಬೈಲ್ 46 ಆಗಿರುವುದರಿಂದ, ಇದು ಮಧ್ಯಮ ಎತ್ತರದ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ ಈ ಸಂಭಾವ್ಯ ಅಮಿಲೋಡೋಜೆನಿಕ್ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಒಟ್ಟು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಫೈಬ್ರಿಲ್ ರಚನೆಗೆ ನಿರ್ಣಾಯಕ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ತಲುಪಬಹುದು.ಈ ತಾರ್ಕಿಕತೆಯನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿ, ನಾವು ಸ್ಪೈಡ್ರೊಯಿನ್ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಜಿಲೇಶನ್ ಸಮಯದ (Fig. 1c) ನಡುವೆ ನಕಾರಾತ್ಮಕ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ NT ಅನುರೂಪವನ್ನು ರೂಪಾಂತರಗಳ ಮೂಲಕ (NT*, His-NT-L6) ಅಥವಾ ಉಪ್ಪು ಸೇರ್ಪಡೆಯಿಂದ ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸಿದರೆ, ತಡೆಯಬಹುದು ರಚನೆ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್ಗಳು (ಚಿತ್ರ 5).
ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳು ದ್ರಾವಣದಿಂದ ಅವಕ್ಷೇಪವಾಗಿ ಕಣ್ಮರೆಯಾಗುತ್ತವೆ, ಆದರೆ ಕೆಲವು ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಅವು ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ರಚಿಸಬಹುದು 55,56,57.ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್-ರೂಪಿಸುವ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಆಕಾರ ಅನುಪಾತವನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಆಣ್ವಿಕ ಎಂಟ್ಯಾಂಗಲ್‌ಮೆಂಟ್ ಮೂಲಕ ಸ್ಥಿರವಾದ ಮೂರು-ಆಯಾಮದ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ, 55,58 ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತವೆ.ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್ ರಚನೆಗೆ, ಪ್ರೋಟೀನ್ಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಅಥವಾ ಭಾಗಶಃ ತೆರೆದುಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಸಾವಯವ ದ್ರಾವಕಗಳಿಗೆ ಒಡ್ಡಿಕೊಳ್ಳುವುದರಿಂದ, ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನ (70-90 ° C) ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಕಡಿಮೆ pH (1.5-3.0)59,60,61,62.ಇಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಲಾದ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳಿಗೆ ಕಠಿಣ ಸಂಸ್ಕರಣೆ ಅಗತ್ಯವಿಲ್ಲ, ಅಥವಾ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸಲು ಅಡ್ಡ-ಲಿಂಕ್ ಮಾಡುವ ಏಜೆಂಟ್‌ಗಳ ಅಗತ್ಯವಿರುವುದಿಲ್ಲ.
ರೇಷ್ಮೆ ನೂಲುವ ಸಮಯದಲ್ಲಿ β-ಶೀಟ್ ಸ್ವಿಚಿಂಗ್‌ಗೆ ಒಳಗಾಗುವ ಸ್ಪಿಡ್ರೊಯಿನ್ ಪುನರಾವರ್ತನೆಗಳು ಮತ್ತು ಕ್ಯೂಡಿಗಳು ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ಹಿಂದೆ ವರದಿಯಾಗಿದೆ.ನಮ್ಮ ಸಂಶೋಧನೆಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ಕಾವುಕೊಡುವ ಸಮಯಗಳು ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಕಾವು ತಾಪಮಾನವು ಕ್ರಮವಾಗಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಉದ್ದವಾಗಿದೆ ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಅಪಾರದರ್ಶಕವಾಗಿರುತ್ತವೆ (ಚಿತ್ರ 7 ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. ವೇಗದ ಜೆಲ್ ಸಮಯಗಳ ಜೊತೆಗೆ, NT ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳು >300 mg/mL (30%) ಎಲ್ಲಾ ಇತರ ವಿವರಿಸಿದ ಮರುಸಂಯೋಜಕ ಸ್ಪೈಡರ್ ಸಿಲ್ಕ್ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ಮೀರಿಸಿದೆ, ಹಾಗೆಯೇ ನೈಸರ್ಗಿಕ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳಾದ ಜೆಲಾಟಿನ್, ಆಲ್ಜಿನೇಟ್ (2%), ಅಗರ್ (0.5 %) ) ಮತ್ತು ಕಾಲಜನ್.(0.6%) (ಚಿತ್ರ 7 ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕಗಳು 1 ಮತ್ತು 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳ ಜೆಲ್ ಸಮಯ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿತಿಸ್ಥಾಪಕ ಮಾಡ್ಯುಲಸ್ ಅನ್ನು ಇತರ ಸ್ಪೈಡ್ರೊಯಿನ್ ಆಧಾರಿತ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಆಯ್ದ ನೈಸರ್ಗಿಕ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಹೋಲಿಸಲಾಗಿದೆ.ಜಿಲೇಶನ್ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳ ವಿವರಣೆಯೊಂದಿಗೆ ಉಲ್ಲೇಖಗಳನ್ನು ನೀಡಲಾಗಿದೆ.APS ಅಮೋನಿಯಂ ಪರ್ಸಲ್ಫೇಟ್, ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶ.ಡೇಟಾ 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
ಶೇಖರಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಸ್ಪೈಡ್ರೊಯಿನ್ ಅನ್ನು ಜೆಲ್ಲಿಂಗ್ ಮಾಡುವುದನ್ನು ತಡೆಯಲು ಜೇಡಗಳು ಮಾರ್ಗಗಳನ್ನು ಅಭಿವೃದ್ಧಿಪಡಿಸಿವೆ.ರೇಷ್ಮೆ ಗ್ರಂಥಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, ಟರ್ಮಿನಲ್ ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ದೊಡ್ಡ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಪ್ರದೇಶವು ಗ್ರಂಥಿಯಲ್ಲಿನ NT ಮತ್ತು CT ಯ ಸ್ಪಷ್ಟ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಈ ಅಧ್ಯಯನದ ಗಡಿಯಲ್ಲಿ ಸುಮಾರು 10-20 mg/ml ಗೆ ಅನುರೂಪವಾಗಿದೆ.ವಿಟ್ರೊ ಗಮನಿಸಿದ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್ ರಚನೆಗೆ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, ರೇಷ್ಮೆ ಗ್ರಂಥಿಗಳಲ್ಲಿ (Fig. 5b) 16 ಲವಣಗಳ ಇದೇ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳು NT ಅನ್ನು ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸಿದವು.NT ಸಂರಚನೆಯನ್ನು E. ಕೊಲಿ ಸೈಟೋಸೋಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ವಿಟ್ರೊದಲ್ಲಿ ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದಾಗ ಹೆಚ್ಚು ಬಿಗಿಯಾಗಿ ಮಡಚಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಎಂದು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ, ಉಪ್ಪು ಅಥವಾ ಇತರ ಅಂಶಗಳು ವಿವೊದಲ್ಲಿ ಅದರ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, NT ಗಳು β-ಶೀಟ್ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳಾಗಿ ರೂಪಾಂತರಗೊಳ್ಳುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವು ತಂತು ರಚನೆಗೆ ಪ್ರಮುಖವಾಗಬಹುದು ಮತ್ತು ಭವಿಷ್ಯದ ಅಧ್ಯಯನಗಳಲ್ಲಿ ತನಿಖೆ ಮಾಡಬೇಕು.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಲಾದ NT-ಅಮಿಲೋಯ್ಡ್ ತರಹದ ಫೈಬ್ರಿಲ್ ಮತ್ತು ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್ ರಚನೆಯ ಹೊಸ ಅಂಶಗಳ ಜೊತೆಗೆ, ಈ ವಿದ್ಯಮಾನವು ಜೈವಿಕ ತಂತ್ರಜ್ಞಾನ ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ವೈದ್ಯಕೀಯ ಅನ್ವಯಿಕೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ (ಚಿತ್ರ 8).ಪರಿಕಲ್ಪನೆಯ ಪುರಾವೆಯಾಗಿ, ನಾವು NT ಯನ್ನು GFP ಅಥವಾ PNP ಯೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್ 37 °C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಟ್ಟಾಗ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು GFP ಮತ್ತು PNP ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ತಮ್ಮ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಜಿಲೇಶನ್ ನಂತರ ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ (ಚಿತ್ರ 6).ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಸೈಡ್ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಸ್‌ಗಳು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಸೈಡ್ ಅನಲಾಗ್‌ಗಳ ಸಂಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರಮುಖ ವೇಗವರ್ಧಕಗಳಾಗಿವೆ, ಇದು ಜೈವಿಕ ಔಷಧೀಯ ಉದ್ಯಮಕ್ಕೆ ನಮ್ಮ ಸಂಶೋಧನೆಯನ್ನು ಪ್ರಸ್ತುತವಾಗಿಸುತ್ತದೆ.ಅನುಕೂಲಕರ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಪಾರದರ್ಶಕ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುವ ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸುವ ಪರಿಕಲ್ಪನೆಯು ಕಿಣ್ವ ನಿಶ್ಚಲತೆ, ನಿಯಂತ್ರಿತ ಔಷಧ ಬಿಡುಗಡೆ ಮತ್ತು ಅಂಗಾಂಶ ಎಂಜಿನಿಯರಿಂಗ್‌ನಂತಹ ವ್ಯಾಪಕ ಶ್ರೇಣಿಯ ಅನ್ವಯಿಕೆಗಳಿಗೆ ಅನುಕೂಲಕರ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳೊಂದಿಗೆ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ರಚಿಸಲು ಅನುಮತಿಸುತ್ತದೆ.ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, NT ಮತ್ತು NT* ಸಮರ್ಥ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿ ಗುರುತುಗಳು30, ಅಂದರೆ NT ಮತ್ತು ಅದರ ರೂಪಾಂತರಗಳನ್ನು ಕರಗುವ ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಹೆಚ್ಚಿನ-ಥ್ರೋಪುಟ್ ಉತ್ಪಾದನೆಗೆ ಮತ್ತು 3D ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ನಿಶ್ಚಲ ಗುರಿಯ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ನಂತರದ ಸೃಷ್ಟಿಗೆ ಬಳಸಬಹುದು.
NT ಕರಗಬಲ್ಲದು, α-ಹೆಲಿಕಲ್ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ (µM) ಮತ್ತು 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಅದೇ ತಾಪಮಾನದಲ್ಲಿ, ಆದರೆ ಹೆಚ್ಚುತ್ತಿರುವ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ (>10 mg/ml), NT ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ತರಹದ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ.NT ಸಮ್ಮಿಳನ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಸಂಪೂರ್ಣ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಸಮ್ಮಿಳನ ತುಣುಕುಗಳೊಂದಿಗೆ ಫೈಬ್ರಿಲ್ಲಾರ್ ಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ಸಹ ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ, ಇದು NT ಬಳಸಿಕೊಂಡು 3D ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವಿವಿಧ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ನಿಶ್ಚಲಗೊಳಿಸಲು ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ.ಕೆಳಗೆ: NT (PDB: 4FBS) ಮತ್ತು ಫೈಬರ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಸಂಬಂಧಿತ ಪ್ರೊಟೀನ್ ರಚನೆಗಳ ವಿವರಣೆಗಳು (ಊಹಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸ್ಕೇಲ್‌ಗೆ ಎಳೆಯಲಾಗಿಲ್ಲ, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.224RJ/pdpdbdbdb).
ರಚನೆಗಳನ್ನು (ಅಮೈನೋ ಆಸಿಡ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ ಸಂಪೂರ್ಣ ಪಟ್ಟಿಗಾಗಿ ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 4 ಅನ್ನು ನೋಡಿ) ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ pT7 ಗೆ ಕ್ಲೋನ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು E. ಕೊಲಿ BL21 (DE3) ಆಗಿ ರೂಪಾಂತರಗೊಂಡಿದೆ.ಇಂಜಿನಿಯರ್ಡ್ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಇ.ಕೋಲಿಯನ್ನು ಲೂರಿಯಾ ಸಾರುಗೆ ಕನಾಮೈಸಿನ್ (70 mg/l) ನೊಂದಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ 30 ° C ಮತ್ತು 250 rpm ನಲ್ಲಿ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು.ನಂತರ ಸಂಸ್ಕೃತಿಯನ್ನು 1/100 LB ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ ಕನಾಮೈಸಿನ್ ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿತ್ತು ಮತ್ತು 30 ° C ಮತ್ತು 110 rpm ನಲ್ಲಿ OD600 0.8 ತಲುಪುವವರೆಗೆ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು.NMR ಅಧ್ಯಯನಕ್ಕಾಗಿ, ಬ್ಯಾಕ್ಟೀರಿಯಾವನ್ನು M9 ಕನಿಷ್ಠ ಮಾಧ್ಯಮದಲ್ಲಿ 2 ಗ್ರಾಂ D-ಗ್ಲೂಕೋಸ್ 13C (ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ಮತ್ತು 1 ಗ್ರಾಂ ಅಮೋನಿಯಂ ಕ್ಲೋರೈಡ್ 15N (ಕೇಂಬ್ರಿಡ್ಜ್ ಐಸೊಟೋಪ್ ಲ್ಯಾಬೊರೇಟರೀಸ್, Inc.) ಐಸೊಟೋಪ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ ಬೆಳೆಸಲಾಯಿತು.ತಾಪಮಾನವನ್ನು 20 ಡಿಗ್ರಿ ಸೆಲ್ಸಿಯಸ್‌ಗೆ ಇಳಿಸಿ ಮತ್ತು 0.15 mM ಐಸೊಪ್ರೊಪಿಲ್ಥಿಯೊಗಲಾಕ್ಟೊಪೈರಾನೊಸೈಡ್ (ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆ) ನೊಂದಿಗೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸುತ್ತದೆ.ರಾತ್ರಿಯ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ನಂತರ, ಕೋಶಗಳನ್ನು 7278×g, 4 ° C ನಲ್ಲಿ 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕೊಯ್ಲು ಮಾಡಲಾಯಿತು.ಕೋಶದ ಉಂಡೆಗಳನ್ನು 20 mM Tris-HCl, pH 8 ರಲ್ಲಿ ಮರುಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಮುಂದಿನ ಬಳಕೆಯವರೆಗೆ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಕರಗಿದ ಕೋಶಗಳನ್ನು 30 kPa ನಲ್ಲಿ ಸೆಲ್ ಡಿಸ್ರಪ್ಟರ್ (TS ಸರಣಿ ಯಂತ್ರಗಳು, ಕಾನ್‌ಸ್ಟೆಂಟ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್ ಲಿಮಿಟೆಡ್, ಇಂಗ್ಲೆಂಡ್) ಬಳಸಿ ಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ನಂತರ ಲೈಸೇಟ್‌ಗಳನ್ನು 25,000 ಗ್ರಾಂನಲ್ಲಿ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 4 ° C ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.NTMiSp ಗಾಗಿ, ಪೆಲೆಟ್ ಅನ್ನು ನಂತರ 2 M ಯೂರಿಯಾ, 20 mM Tris-HCl, pH 8 ನಲ್ಲಿ ಮರುಜೋಡಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 2 ನಿಮಿಷಗಳವರೆಗೆ (2 ಸೆ ಆನ್/ಆಫ್, 65%) ಸೋನಿಕೇಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು, ನಂತರ ಮತ್ತೆ 25,000 xg, 4 ° C. ಒಳಗೆ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು. 30 ನಿಮಿಷಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು Ni-NTA ಕಾಲಮ್‌ಗೆ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು, 20 mM Tris-HCl, 2 mM ಇಮಿಡಾಜೋಲ್, pH 8 ನೊಂದಿಗೆ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನ್ನು 20 mM Tris-HCl, 200 mM ಇಮಿಡಾಜೋಲ್, pH 8 ನೊಂದಿಗೆ ಹೊರಹಾಕಲಾಯಿತು. NT2RepCT ಮತ್ತು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು NTCT, ಥ್ರಂಬಿನ್ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆಯು ಅವನ ಮತ್ತು NT ನಡುವಿನ ಸೈಟ್ (ThrCleav) ಅನ್ನು ಪರಿಚಯಿಸುತ್ತದೆ.ಥ್ರಂಬಿನ್ ಸೀಳುವ ತಾಣಗಳು His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (NT ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (CT ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ), His-Thioredoxin-ThrCleav- .* (ಎನ್‌ಟಿ* ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ), ಹಿಸ್-ಥಿಯೊರೆಡಾಕ್ಸಿನ್-ಥ್ರ್‌ಕ್ಲೀವ್-ಎನ್‌ಟಿಎ72ಆರ್ (ಎನ್‌ಟಿಎ72ಆರ್ ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ), ಹಿಸ್-ಥಿಯೊರೆಡಾಕ್ಸಿನ್-ಥ್ರ್‌ಕ್ಲೀವ್-ಎನ್‌ಟಿಎಫ್‌ಎಲ್‌ಎಸ್‌ಪಿ (ಎನ್‌ಟಿಎಫ್ 1ಎಸ್‌ಪಿ ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ), ಮತ್ತು ಹಿಸ್-ಸಲ್ಫರ್ ರೆಡಾಕ್ಸಿನ್-ಥ್ರ್‌ಕ್ಲೀವ್-ಎನ್‌ಟಿಎಂಎಸ್‌ಪಿ (ಎನ್‌ಟಿಎಂಐಎಸ್‌ಪಿಡಿಸಿ).ರಚನೆಗಳನ್ನು ಥ್ರಂಬಿನ್ (1:1000) ನೊಂದಿಗೆ ಜೀರ್ಣಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 6-8 kDa ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದ ಮಿತಿಯೊಂದಿಗೆ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ/ಪೋರ್ ಡಯಾಲಿಸಿಸ್ ಮೆಂಬರೇನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು 20 mM Tris-HCl, pH 8 ನೊಂದಿಗೆ 4 ° C ನಲ್ಲಿ ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ ಡಯಾಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು.ಡಯಾಲಿಸಿಸ್ ನಂತರ, ಪರಿಹಾರವನ್ನು Ni-NTA ಕಾಲಮ್‌ಗೆ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಆಸಕ್ತಿಯ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಹೊಂದಿರುವ ತ್ಯಾಜ್ಯವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.NTF1Sp ಹೊರತುಪಡಿಸಿ, ತಯಾರಕರ ಪ್ರೋಟೋಕಾಲ್ ಪ್ರಕಾರ ಬ್ರಾಡ್‌ಫೋರ್ಡ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸುವ ಪ್ರತಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಅಳಿವಿನ ಗುಣಾಂಕವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು 280 nm ನಲ್ಲಿ UV ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಶುದ್ಧತೆಯನ್ನು SDS ಪಾಲಿಅಕ್ರಿಲಮೈಡ್ (4-20%) ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್ ಮತ್ತು ಕೂಮಾಸ್ಸಿ ಅದ್ಭುತ ನೀಲಿ ಬಣ್ಣದಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.4000 xg ನಲ್ಲಿ ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಜ್ ಫಿಲ್ಟರ್‌ಗಳನ್ನು (ವಿವಾಸ್ಪಿನ್ 20, GE ಹೆಲ್ತ್‌ಕೇರ್) ಬಳಸಿಕೊಂಡು 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಚಕ್ರಗಳಲ್ಲಿ 10 kDa ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದ ಕಡಿತದೊಂದಿಗೆ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಪ್ರೋಟೀನ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ಕರಗಿಸಿ ಮತ್ತು 150 µl ಅನ್ನು 1 ಮಿಲಿ ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಸೆಪ್ಟಮ್ ಸೀಸೆಗೆ (8 x 40 mm ಥರ್ಮೋ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್) ಎಚ್ಚರಿಕೆಯಿಂದ ಪೈಪ್ ಮಾಡಿ.ಆವಿಯಾಗುವಿಕೆಯನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ಯಾರಾಫಿಲ್ಮ್‌ನಿಂದ ಮುಚ್ಚಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮುಚ್ಚಲಾಯಿತು.ಮಾದರಿಗಳನ್ನು (n = 3) 37 ° C ಅಥವಾ 60 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಿಯತಕಾಲಿಕವಾಗಿ ಜಿಲೇಶನ್ ಅನ್ನು ವೀಕ್ಷಿಸಲು ತಲೆಕೆಳಗಾದವು.ಜೆಲ್ ಮಾಡದ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಕನಿಷ್ಠ ಒಂದು ವಾರದವರೆಗೆ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿ 10 μM ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗೆ 10 mM DTT ಯೊಂದಿಗೆ NTMiSp ಡೈಸಲ್ಫೈಡ್ ಬಾಂಡ್‌ಗಳನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ.ನೈಸರ್ಗಿಕ ಸ್ಪೈಡರ್ ರೇಷ್ಮೆ ಲೇಪನಗಳ ಜಿಲೇಶನ್ ಅನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು, ಸ್ವೀಡಿಷ್ ಸೇತುವೆಯ ಜೇಡವನ್ನು ಕತ್ತರಿಸಲಾಯಿತು, ಎರಡು ಪ್ರಮುಖ ಆಂಪ್ಯುಲೇಟೆಡ್ ಗ್ರಂಥಿಗಳನ್ನು 20 mM ಟ್ರಿಸ್-HCl ಬಫರ್ pH 8 ನ 200 μl ನಲ್ಲಿ ಇರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಲೇಪನವನ್ನು ಗ್ರಂಥಿಗಳಿಂದ ಬೇರ್ಪಡಿಸಲು ಅನುಮತಿಸಲು ಕತ್ತರಿಸಲಾಯಿತು..ಗ್ರಂಥಿಗಳ ವಿಷಯಗಳನ್ನು ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಕರಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಒಣ ತೂಕವನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು 50 µl (ತೆರೆದ ಬಾಟಲುಗಳನ್ನು 60 °C ಸ್ಥಿರ ತೂಕಕ್ಕೆ ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ) ಮತ್ತು 37 °C ನಲ್ಲಿ ಜಿಲೇಶನ್‌ಗಾಗಿ 150 µl.
ಅಳತೆ ಮಾಡುವ ಜ್ಯಾಮಿತಿ/ಉಪಕರಣವನ್ನು ಸ್ಟೇನ್‌ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್‌ನಿಂದ 20 ಮಿಮೀ ಮೇಲ್ಭಾಗದ ವ್ಯಾಸ ಮತ್ತು 0.5 ಮಿಮೀ ಅಂತರವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಸಮಾನಾಂತರ ಪ್ಲೇಟ್ ಬಳಸಿ ತಯಾರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಸ್ಟೇನ್‌ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ ಬಾಟಮ್ ಪೆಲ್ಟಿಯರ್ ಪ್ಲೇಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರತಿ ನಿಮಿಷಕ್ಕೆ 1 °C ದರದಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು 25 °C ನಿಂದ 45 °C ಮತ್ತು 25 °C ಗೆ ಬಿಸಿ ಮಾಡಿ.ಕಂಪನ ಮಾಪನಗಳನ್ನು 0.1 Hz ಆವರ್ತನದಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ವಸ್ತುಗಳ ರೇಖೀಯ ವಿಸ್ಕೋಲಾಸ್ಟಿಕ್ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿ ಕ್ರಮವಾಗಿ 100 mg/mL ಮತ್ತು 300-500 mg/mL ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ 5% ಮತ್ತು 0.5% ಸ್ಟ್ರೈನ್ ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಆವಿಯಾಗುವಿಕೆಯನ್ನು ತಡೆಯಲು ಕಸ್ಟಮ್ ಆರ್ದ್ರತೆಯ ಕೋಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿ.ಪ್ರಿಸ್ಮ್ 9 ಬಳಸಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.
800 ರಿಂದ 3900 cm–1 ವರೆಗಿನ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಅತಿಗೆಂಪು (IR) ವರ್ಣಪಟಲವನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸುವುದಕ್ಕಾಗಿ.ATR ಸಾಧನ, ಹಾಗೆಯೇ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ ಮೂಲಕ ಬೆಳಕಿನ ಮಾರ್ಗವನ್ನು ಪ್ರಯೋಗದ ಮೊದಲು ಮತ್ತು ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಶುಷ್ಕ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಿದ ಗಾಳಿಯಿಂದ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪರಿಹಾರಗಳನ್ನು (500 mg/mL ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾದಲ್ಲಿನ ನೀರಿನ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯ ಶಿಖರಗಳನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು) ಸ್ಫಟಿಕಗಳ ಮೇಲೆ ಪೈಪ್ ಹಾಕಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು (500 mg/mL) ಮಾಪನಕ್ಕೆ ಮೊದಲು ರಚಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ನಂತರ ಸ್ಫಟಿಕಗಳಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು (n = 3).1000 ಸ್ಕ್ಯಾನ್‌ಗಳನ್ನು 2 cm-1 ರ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಮತ್ತು 2 ರ ಶೂನ್ಯ ಡ್ಯೂಟಿ ಸೈಕಲ್‌ನೊಂದಿಗೆ ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ. ಎರಡನೇ ವ್ಯುತ್ಪನ್ನವನ್ನು OPUS (Bruker) ಬಳಸಿ ಒಂಬತ್ತು ಪಾಯಿಂಟ್‌ಗಳ ಸುಗಮ ಶ್ರೇಣಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ.1720 ಮತ್ತು 1580 cm-1 ರ ನಡುವೆ F. Menges "Spectragryph - ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್" ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವನ್ನು ಅದೇ ಏಕೀಕರಣ ಪ್ರದೇಶಕ್ಕೆ ಸಾಮಾನ್ಯಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು.ATR-IR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಯಲ್ಲಿ, ಮಾದರಿಯೊಳಗೆ ಅತಿಗೆಂಪು ಕಿರಣದ ಒಳಹೊಕ್ಕು ಆಳವು ತರಂಗಸಂಖ್ಯೆಯ ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿದೆ, ಇದು ಹೆಚ್ಚಿನ ತರಂಗಸಂಖ್ಯೆಗಳಿಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ ತರಂಗಸಂಖ್ಯೆಗಳಲ್ಲಿ ಬಲವಾದ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.ಅಂಜೂರದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾಗೆ ಈ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ.3 ಏಕೆಂದರೆ ಅವು ತುಂಬಾ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿರುತ್ತವೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 4).Bruker OPUS ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಈ ಅಂಕಿ-ಅಂಶಕ್ಕೆ ಸರಿಪಡಿಸಲಾದ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ.
ತಾತ್ವಿಕವಾಗಿ, ಅಮೈಡ್ I ಶಿಖರದೊಳಗಿನ ಘಟಕಗಳ ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹ ಡಿಕಾನ್ವಲ್ಯೂಷನ್ ನಂತರ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಗಳ ಸಮಗ್ರ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣವು ಸಾಧ್ಯ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಆಚರಣೆಯಲ್ಲಿ ಕೆಲವು ಅಡೆತಡೆಗಳು ಉದ್ಭವಿಸುತ್ತವೆ.ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್‌ನಲ್ಲಿನ ಶಬ್ದವು ಡಿಕಾನ್ವಲ್ಯೂಷನ್ ಸಮಯದಲ್ಲಿ (ಸುಳ್ಳು) ಶಿಖರಗಳಂತೆ ಕಾಣಿಸಬಹುದು.ಇದರ ಜೊತೆಯಲ್ಲಿ, ನೀರಿನ ಬಾಗುವಿಕೆಯಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಶಿಖರವು ಅಮೈಡ್ I ಪೀಕ್‌ನ ಸ್ಥಾನದೊಂದಿಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಇಲ್ಲಿ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಿದ ಜಲೀಯ ಜೆಲ್‌ನಂತಹ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದ ನೀರನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಹೊಂದಿರಬಹುದು.ಆದ್ದರಿಂದ, ನಾವು ಅಮೈಡ್ I ಪೀಕ್ ಅನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಕೊಳೆಯಲು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಲಿಲ್ಲ, ಮತ್ತು ನಮ್ಮ ಅವಲೋಕನಗಳನ್ನು NMR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಯಂತಹ ಇತರ ವಿಧಾನಗಳಿಗೆ ಬೆಂಬಲವಾಗಿ ಪರಿಗಣಿಸಬೇಕು.
50 mg/ml NT ಮತ್ತು His-NT2RepCT ಯ ಪರಿಹಾರಗಳನ್ನು ರಾತ್ರಿಯಲ್ಲಿ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಜೆಲ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ನಂತರ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್ ಅನ್ನು 20 mM Tris-HCl (pH 8) ನೊಂದಿಗೆ 12.5 mg/ml ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, ಚೆನ್ನಾಗಿ ಅಲ್ಲಾಡಿಸಿ ಮತ್ತು ಜೆಲ್ ಅನ್ನು ಒಡೆಯಲು ಪೈಪೆಟ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು.ಮುಂದೆ, ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್ ಅನ್ನು 20 mM Tris-HCl (pH 8) ನೊಂದಿಗೆ 10 ಬಾರಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, 5 μl ಮಾದರಿಯನ್ನು ಫಾರ್ಮ್ವರ್ನೊಂದಿಗೆ ಲೇಪಿತವಾದ ತಾಮ್ರದ ಗ್ರಿಡ್ಗೆ ಅನ್ವಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಬ್ಲಾಟಿಂಗ್ ಪೇಪರ್ನಿಂದ ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು.ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 5 µl ಮಿಲಿಕ್ಯೂ ನೀರಿನಿಂದ ಎರಡು ಬಾರಿ ತೊಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 1% ಯುರೇನಿಲ್ ಫಾರ್ಮೇಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಲೆ ಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವ ಕಾಗದದಿಂದ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಸ್ಟೇನ್ ತೆಗೆದುಹಾಕಿ, ನಂತರ ಜಾಲರಿಯನ್ನು ಗಾಳಿಯಲ್ಲಿ ಒಣಗಿಸಿ.100 kV ಯಲ್ಲಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುವ FEI Tecnai 12 ಸ್ಪಿರಿಟ್ BioTWIN ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಈ ಗ್ರಿಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಚಿತ್ರಣವನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.Veleta 2k × 2k CCD ಕ್ಯಾಮರಾ (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು x 26,500 ಮತ್ತು x 43,000 ವರ್ಧನೆಗಳಲ್ಲಿ ದಾಖಲಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಗೆ (n = 1), 10-15 ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ದಾಖಲಿಸಲಾಗಿದೆ.ಇಮೇಜ್‌ಜೆ (https://imagej.nih.gov/) ಅನ್ನು ಚಿತ್ರದ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಫೈಬರ್ ವ್ಯಾಸಗಳ ಅಳತೆಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ (n = 100, ವಿಭಿನ್ನ ಫೈಬರ್‌ಗಳು).ಪ್ರಿಸ್ಮ್ 9 ಅನ್ನು ಜೋಡಿಯಾಗದ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಗಳನ್ನು (ಎರಡು-ಬಾಲದ) ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು.ಸರಾಸರಿ His-NT2RepCT ಮತ್ತು NT ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳು ಕ್ರಮವಾಗಿ 11.43 (SD 2.035) ಮತ್ತು 7.67 (SD 1.389) nm.ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹ ಮಧ್ಯಂತರ (95%) -4.246 ರಿಂದ -3.275.ಸ್ವಾತಂತ್ರ್ಯದ ಡಿಗ್ರಿ = 198, ಪು <0.0001.
10 µM ಥಿಯೋಫ್ಲಾವಿನ್ T (ThT) ಹೊಂದಿರುವ 80 µl ದ್ರವ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಕಾರ್ನಿಂಗ್ 96-ವೆಲ್ ಬ್ಲ್ಯಾಕ್ ಬಾಟಮ್ ಕ್ಲಿಯರ್ ಬಾಟಮ್ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು (ಕಾರ್ನಿಂಗ್ ಗ್ಲಾಸ್ 3881, USA) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸ್ಥಿರ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಮೂರು (n = 3) ನಲ್ಲಿ ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.440 nm ಪ್ರಚೋದಕ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮತ್ತು 480 nm ಹೊರಸೂಸುವಿಕೆ ಫಿಲ್ಟರ್ (BMG ಲ್ಯಾಬ್ಟೆಕ್, ಆಫೆನ್ಬರ್ಗ್, ಜರ್ಮನಿಯಿಂದ FLUOStar ಗ್ಯಾಲಕ್ಸಿ) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ದಾಖಲಿಸಲಾಗಿದೆ.ThT ಸಂಕೇತವು ಸ್ಯಾಚುರೇಟೆಡ್ ಆಗಿರಲಿಲ್ಲ ಅಥವಾ ತಣಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿಲ್ಲ, ಏಕೆಂದರೆ ಸಿಗ್ನಲ್ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ಬದಲಾಯಿಸದೆ ThT ಯ ವಿಭಿನ್ನ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಮಬ್ಬು ಮಾಪನಕ್ಕಾಗಿ 360 nm ನಲ್ಲಿ ರೆಕಾರ್ಡ್ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆ.ಬಿತ್ತನೆಯ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗಾಗಿ, 100 mg/mL ಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು 37 ° C. ನಲ್ಲಿ ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ, ಮರುಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 5%, 10% ಮತ್ತು 20% ನ ಮೋಲಾರ್ ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಬಿತ್ತನೆಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರಿಸ್ಮ್ 9 ಬಳಸಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ His-NT2RepCT ಮತ್ತು NT >100 mg/mL ಸ್ಟಾಕ್‌ಗಳನ್ನು ಕರಗಿಸಿ ಮತ್ತು 0.22 µm ಫಿಲ್ಟರ್ ಮೂಲಕ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಿ.ನ್ಯಾನೊಡ್ರಾಪ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು 280 nm ನಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.ಸ್ಪಷ್ಟ ತಳವಿರುವ 96-ಬಾವಿ ಕಪ್ಪು ನಾನ್-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಪ್ಲೇಟ್‌ನ (ಕಾರ್ನಿಂಗ್) ಬಾವಿಗಳಲ್ಲಿ, ಮಾದರಿಗಳನ್ನು 20 mM Tris-HCl pH 8 ರಲ್ಲಿ 20 mg/ml ಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 5 μM ThT (ಅಂತಿಮ ಸಾಂದ್ರತೆ), ಒಟ್ಟು ಮಾದರಿ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಬೆರೆಸಲಾಗುತ್ತದೆ. 50 μl ಪರಿಮಾಣ.TTH ಇಮೇಜಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ ಪ್ರಸಾರವಾದ ಬೆಳಕಿನ ಚಾನಲ್ ಮತ್ತು FITC ಪ್ರಚೋದನೆ ಮತ್ತು ಹೊರಸೂಸುವಿಕೆ ಫಿಲ್ಟರ್ ಸೆಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ CellObserver (Zeiss) ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿ 10 ನಿಮಿಷಗಳಿಗೊಮ್ಮೆ 37 °C ನಲ್ಲಿ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಚಿತ್ರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಚಿತ್ರಣಕ್ಕಾಗಿ 20x/0.4 ಲೆನ್ಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಝೆನ್ ಬ್ಲೂ (Zeiss) ಮತ್ತು ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ಅನ್ನು ಚಿತ್ರ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.20 mM Tris pH 8 ಮತ್ತು 5 µM ThT ಹೊಂದಿರುವ 50 mg/mL ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ NT ಮತ್ತು His-NT2RepCT ದ್ರಾವಣಗಳಿಂದ ಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ತಯಾರಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 90 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಕಾವುಕೊಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಜೆಲ್ ತುಣುಕುಗಳನ್ನು 20 mM ಟ್ರಿಸ್, pH 8 ಮತ್ತು 5 μM ThT ಹೊಂದಿರುವ ಹೊಸ ಬಾವಿಗೆ ಬಂಧಿಸದ ಕಪ್ಪು 96 ಚೆನ್ನಾಗಿ ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ಕೆಳಭಾಗದ ಪ್ಲೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು.20x/0.4 ವರ್ಧನೆಯಲ್ಲಿ ಹಸಿರು ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಮತ್ತು ಪ್ರಕಾಶಮಾನವಾದ ಕ್ಷೇತ್ರ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಪಡೆದುಕೊಳ್ಳಿ.ಚಿತ್ರ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ImageJ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.
QCI ಕ್ವಾಡ್ರುಪೋಲ್ ರೆಸೋನೆನ್ಸ್ ಪಲ್ಸ್ಡ್ ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಫೀಲ್ಡ್ ಕ್ರಯೋಪ್ರೋಬ್ (HFCN) ನೊಂದಿಗೆ 600 MHz ಬ್ರೂಕರ್ ಅವಾನ್ಸ್ ನಿಯೋ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್‌ನಲ್ಲಿ ಪರಿಹಾರ NMR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವನ್ನು 310 K ನಲ್ಲಿ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.13C, 15N ನೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ 10 mg/mL ಏಕರೂಪದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಹೊಂದಿರುವ NMR ಮಾದರಿಗಳು, 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .15N-HSQC ಯ 2D ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್‌ನಲ್ಲಿ ಗರಿಷ್ಠ 23 ಅನ್ನು ನಿಯೋಜಿಸಲು pH 6.7 ನಲ್ಲಿ NT2RepCT ಯ ರಾಸಾಯನಿಕ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.
ಮ್ಯಾಜಿಕ್ ಕೋನ ಸ್ಪಿನ್ನಿಂಗ್ ಘನ NMR (MAS) ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ 13C, 15N-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಹೈಡ್ರೋಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ಬ್ರೂಕರ್ ಅವಾನ್ಸ್ III HD ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್‌ನಲ್ಲಿ 800 MHz ನಲ್ಲಿ 3.2 mm 13C/15N{1H} ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್‌ಲೆಸ್ ಪ್ರೋಬ್‌ನೊಂದಿಗೆ ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಮಾದರಿ ತಾಪಮಾನವನ್ನು 277 K ನಲ್ಲಿ ವೇರಿಯಬಲ್ ತಾಪಮಾನದ ಅನಿಲ ಸ್ಟ್ರೀಮ್ ಬಳಸಿ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗಿದೆ. ಎರಡು ಆಯಾಮದ ದ್ವಿಧ್ರುವಿ ತಿರುಗುವಿಕೆಯ ಅನುರಣನ (DARR)76 ಮತ್ತು ರೇಡಿಯೋ ಆವರ್ತನ ಮರುಸಂಪರ್ಕ (RFDR)77 ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವನ್ನು ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ 12.5 kHz ಮತ್ತು 20 kHz ನ MAS ಆವರ್ತನಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ವಾಧೀನಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ.1H ನಿಂದ 13C ವರೆಗಿನ ಅಡ್ಡ ಧ್ರುವೀಕರಣ (CP) ಅನ್ನು 1H ನಲ್ಲಿ 60.0 ರಿಂದ 48.0 kHz ವರೆಗೆ ರೇಖಾತ್ಮಕ ರಾಂಪ್ ಬಳಸಿ, 13C ನಲ್ಲಿ 61.3/71.6 kHz (12.5/20 kHz MAS ನಲ್ಲಿ) ಮತ್ತು ಸಂಪರ್ಕ ಸಮಯ 0.5-1 ms.ಡೇಟಾ ಸಂಗ್ರಹಣೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ 73.5 kHz ನಲ್ಲಿ ಸ್ಪೈನಲ್6478 ಡಿಕೌಪ್ಲಿಂಗ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.ಸ್ವಾಧೀನಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳುವ ಸಮಯ 10 ಮಿಲಿಸೆಕೆಂಡುಗಳು ಮತ್ತು ಸೈಕಲ್ ವಿಳಂಬವು 2.5 ಸೆಕೆಂಡುಗಳು.RFDR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾದಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಲಾದ ಏಕ-ಸಂಯೋಜಿತ Cα/Cβ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧಗಳನ್ನು ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಶೇಷ-ರೀತಿಯ ರಾಸಾಯನಿಕ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಮತ್ತು DARR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾದಲ್ಲಿನ ಗುಣಿಸಿ-ಸಂಯೋಜಿತ ಸಂಬಂಧಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ನಿಯೋಜಿಸಲಾಗಿದೆ.
Zipper79 ಡೇಟಾಬೇಸ್ (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) ಅನ್ನು NT, NTFlSp, ಮತ್ತು NTMiSp ಗಾಗಿ ಫ್ಲಟರ್ ಪ್ರವೃತ್ತಿಗಳು ಮತ್ತು ರೊಸೆಟ್ಟಾ ಶಕ್ತಿಯನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಜಿಪ್ಪರ್ ಡೇಟಾಬೇಸ್ ರೊಸೆಟ್ಟಾ ಎನರ್ಜಿ80 ಅನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡುತ್ತದೆ, ಇದು ಪ್ರೋಟೀನ್ ರಚನೆಯನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು ಹಲವಾರು ಉಚಿತ ಶಕ್ತಿ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುತ್ತದೆ.-23 kcal/mol ಅಥವಾ ಅದಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಶಕ್ತಿಯ ಮಟ್ಟವು ಫೈಬ್ರಿಲೇಟ್‌ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಕಡಿಮೆ ಶಕ್ತಿ ಎಂದರೆ ಝಿಪ್ಪರ್ ವಿನ್ಯಾಸದಲ್ಲಿ ಎರಡು β-ಸ್ಟ್ರಾಂಡ್‌ಗಳ ಹೆಚ್ಚು ಸ್ಥಿರತೆ.ಇದರ ಜೊತೆಗೆ, NT, NTFlSp ಮತ್ತು NTMiSp Ref ನಲ್ಲಿ ಅಮಿಲೋಡೋಜೆನಿಕ್ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಊಹಿಸಲು ವಾಲ್ಟ್ಜ್ ಅಲ್ಗಾರಿದಮ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT ಪ್ರೊಟೀನ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು pH 5.5 ಮತ್ತು 6.0 ನಲ್ಲಿ 2-(N-ಮಾರ್ಫೋಲಿನೊ) ಎಥೆನೆಸಲ್ಫೋನಿಕ್ ಆಮ್ಲ (MES) ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಬೆರೆಸಿ ಕ್ರಮವಾಗಿ pH ಅನ್ನು pH 6 ಮತ್ತು 7 ಗೆ ಇಳಿಸಲಾಯಿತು.ಅಂತಿಮ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 100 ಮಿಗ್ರಾಂ / ಮಿಲಿ.
J-1500 CD ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ (JASCO, USA) ನಲ್ಲಿ 0.1 ಸೆಂ.ಮೀ ಆಪ್ಟಿಕಲ್ ಪಥದೊಂದಿಗೆ 300 μL ಕ್ಯೂವೆಟ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮಾಪನಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.20 mM ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್ (pH 8) ನಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು 10 μM (n = 1) ಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಉಪ್ಪಿನ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸ್ಥಿರತೆಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು, ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ 154 mM NaF ಅಥವಾ NaCl ಹೊಂದಿರುವ 20 mM ಫಾಸ್ಫೇಟ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ (pH 8) ಅದೇ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ (n = 1) ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.ತಾಪಮಾನ ಸ್ಕ್ಯಾನ್‌ಗಳನ್ನು 222 nm ನಲ್ಲಿ 25 ° C ನಿಂದ 95 ° C ವರೆಗೆ 1 ° C / ನಿಮಿಷದ ತಾಪನ ದರದೊಂದಿಗೆ ದಾಖಲಿಸಲಾಗಿದೆ.ಸ್ಥಳೀಯವಾಗಿ ಮಡಿಸಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಅನುಪಾತವನ್ನು ಸೂತ್ರವನ್ನು (KDmeasure - KDfinal)/(KDstart - KDfinal) ಬಳಸಿ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ.ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಗೆ 260 nm ನಿಂದ 190 nm ವರೆಗೆ 25 ° C ನಲ್ಲಿ ಮತ್ತು 95 ° C ಗೆ ಬಿಸಿ ಮಾಡಿದ ನಂತರ ಐದು ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾಗಳನ್ನು ದಾಖಲಿಸಲಾಗಿದೆ.ಐದು ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾಗಳನ್ನು ಸರಾಸರಿ, ಸುಗಮಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮೋಲಾರ್ ಎಲಿಪ್ಟಿಸಿಟಿಗೆ ಪರಿವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು.ಪ್ರಿಸ್ಮ್ 9 ಬಳಸಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಅವನ-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) ನ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು 96-ಬಾವಿ ಕಾರ್ನಿಂಗ್ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕಪ್ಪು ಪಾರದರ್ಶಕ ತಳದೊಂದಿಗೆ (ಕಾರ್ನಿಂಗ್ ಗ್ಲಾಸ್ 3881, USA) ಸ್ಥಾಯಿ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಮೂರು ಬಾರಿ (n = 3) ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.395 nm ನ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ತರಂಗಾಂತರದೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿದೀಪಕ-ಆಧಾರಿತ ಪ್ಲೇಟ್ ರೀಡರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಅಳೆಯಿರಿ ಮತ್ತು 509 nm ನಲ್ಲಿ ಜಿಲೇಶನ್‌ಗೆ ಮೊದಲು ಮತ್ತು 2 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ 37 ° C ನಲ್ಲಿ ಹೊರಸೂಸುವಿಕೆಯನ್ನು ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಿ.ಪ್ರಿಸ್ಮ್ 9 ನೊಂದಿಗೆ ಡೇಟಾವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಪ್ಯೂರಿನ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಸೈಡ್ ಫಾಸ್ಫೊರಿಲೇಸ್ ಚಟುವಟಿಕೆಯ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಕಿಟ್ (ಫ್ಲೋರೋಮೆಟ್ರಿಕ್ ವಿಧಾನ, ಸಿಗ್ಮಾ ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್) ತಯಾರಕರ ಸೂಚನೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.His-NT-PNP ಹೊಂದಿರುವ ಜೆಲ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ದ್ರಾವಣಗಳಲ್ಲಿ ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯಲು, 10 ng His-NT-PNP ಅನ್ನು 100 mg/mL NT ನೊಂದಿಗೆ ಒಟ್ಟು 2 µL ಪರಿಮಾಣಕ್ಕೆ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ ಏಕೆಂದರೆ ಜೆಲ್ ಸೆಟ್‌ನ ಪತ್ತೆ ಮಧ್ಯಂತರಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಕೇತವನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ.ಜೆಲ್‌ಗಳ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳು ಮತ್ತು ಹಿಸ್-ಎನ್‌ಟಿ-ಪಿಎನ್‌ಪಿ ಇಲ್ಲದ ಪರಿಹಾರಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಅಳತೆಗಳನ್ನು ಎರಡು ಬಾರಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು (n = 2).ಚಟುವಟಿಕೆಯನ್ನು ಅಳತೆ ಮಾಡಿದ ನಂತರ, ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಮಾಪನದ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಜೆಲ್ ಹಾಗೇ ಉಳಿದಿದೆ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ಜೆಲ್ ಅನ್ನು ಛಾಯಾಚಿತ್ರ ಮಾಡಲಾಯಿತು.ಪ್ರಿಸ್ಮ್ 9 ಬಳಸಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಅಧ್ಯಯನ ವಿನ್ಯಾಸದ ಕುರಿತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಾಹಿತಿಗಾಗಿ, ಈ ಲೇಖನಕ್ಕೆ ಲಿಂಕ್ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರಕೃತಿ ಅಧ್ಯಯನದ ಅಮೂರ್ತವನ್ನು ನೋಡಿ.
ಅಂಕಿ 1 ಮತ್ತು 2 ಆರಂಭಿಕ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸುತ್ತದೆ.1c, 2a-c, 3a, b, e-g, 4, 5b, d, f, ಮತ್ತು 6, ಪೂರಕ ಚಿತ್ರಗಳು.3, ಪೂರಕ ಅಂಜೂರ.5a, d, ಪೂರಕ ಅಂಜೂರ.6 ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಅಂಜೂರ.8. ಈ ಅಧ್ಯಯನದ ಡೇಟಾ ಡೇಟಾವನ್ನು Zenodo ಡೇಟಾಬೇಸ್ https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 ನಲ್ಲಿ ಹೋಸ್ಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಪಡೆದ NMR ಡೇಟಾವನ್ನು bmrbig36 ಪ್ರವೇಶ ID ಅಡಿಯಲ್ಲಿ BMRBig ರೆಪೊಸಿಟರಿಯಲ್ಲಿ ಪೋಸ್ಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.GFP ಮತ್ತು PNP ಯ ರಚನೆಗಳನ್ನು PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2) ನಿಂದ ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ.
ರೈಸಿಂಗ್, ಎ. ಮತ್ತು ಜೋಹಾನ್ಸನ್, ಜೆ. ಸ್ಪಿನ್ನಿಂಗ್ ಕೃತಕ ಸ್ಪೈಡರ್ ಸಿಲ್ಕ್.ರಾಷ್ಟ್ರೀಯ ರಾಸಾಯನಿಕ.ಜೀವಶಾಸ್ತ್ರ.11, 309–315 (2015).
ಬಾಬ್, ಪಿಎಲ್ ಮತ್ತು ಇತರರು.Nephila clavipes ಜೀನೋಮ್ ಸ್ಪೈಡರ್ ರೇಷ್ಮೆ ವಂಶವಾಹಿಗಳ ವೈವಿಧ್ಯತೆ ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಸಂಕೀರ್ಣ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.ರಾಷ್ಟ್ರೀಯ ಜೆನೆಟ್.49, 895–903 (2017).