347 12.7*1.24mm ಸ್ಟೇನ್‌ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ ಕಾಯಿಲ್ಡ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳು, ಸಿಂಕ್ರೊನಸ್ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಘನೀಕರಣದ ಆಣ್ವಿಕ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನ ಮತ್ತು α-ಸಿನ್ಯೂಕ್ಲಿನ್ ಮತ್ತು ಟೌನ ಘನೀಕರಣ

Nature.com ಗೆ ಭೇಟಿ ನೀಡಿದ್ದಕ್ಕಾಗಿ ಧನ್ಯವಾದಗಳು.ನೀವು ಸೀಮಿತ CSS ಬೆಂಬಲದೊಂದಿಗೆ ಬ್ರೌಸರ್ ಆವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಬಳಸುತ್ತಿರುವಿರಿ.ಉತ್ತಮ ಅನುಭವಕ್ಕಾಗಿ, ನೀವು ನವೀಕರಿಸಿದ ಬ್ರೌಸರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲು ನಾವು ಶಿಫಾರಸು ಮಾಡುತ್ತೇವೆ (ಅಥವಾ ಇಂಟರ್ನೆಟ್ ಎಕ್ಸ್‌ಪ್ಲೋರರ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೊಂದಾಣಿಕೆ ಮೋಡ್ ಅನ್ನು ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿ).ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ನಡೆಯುತ್ತಿರುವ ಬೆಂಬಲವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು, ನಾವು ಶೈಲಿಗಳು ಮತ್ತು JavaScript ಇಲ್ಲದೆ ಸೈಟ್ ಅನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ.
ಪ್ರತಿ ಸ್ಲೈಡ್‌ಗೆ ಮೂರು ಲೇಖನಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುವ ಸ್ಲೈಡರ್‌ಗಳು.ಸ್ಲೈಡ್‌ಗಳ ಮೂಲಕ ಚಲಿಸಲು ಹಿಂದಿನ ಮತ್ತು ಮುಂದಿನ ಬಟನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ಅಥವಾ ಪ್ರತಿ ಸ್ಲೈಡ್ ಮೂಲಕ ಚಲಿಸಲು ಕೊನೆಯಲ್ಲಿ ಸ್ಲೈಡ್ ನಿಯಂತ್ರಕ ಬಟನ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ.

347 ಸ್ಟೇನ್ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ ಪೈಪ್ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ

347 12.7*1.24mm ಸ್ಟೇನ್ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ ಸುರುಳಿಯಾಕಾರದ ಕೊಳವೆಗಳು

ಹೊರಗಿನ ವ್ಯಾಸ: 6.00 mm OD ವರೆಗೆ 914.4 mm OD, 24" NB ವರೆಗೆ ಗಾತ್ರಗಳು ಲಭ್ಯವಿದೆ ಎಕ್ಸ್-ಸ್ಟಾಕ್, OD ಗಾತ್ರದ ಸ್ಟೀಲ್ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳು ಎಕ್ಸ್-ಸ್ಟಾಕ್ ಲಭ್ಯವಿದೆ

SS 347 ಪೈಪ್ ದಪ್ಪದ ಶ್ರೇಣಿ: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ಇತ್ಯಾದಿ (0.5-12mm) ಅಥವಾ ಅಗತ್ಯಕ್ಕೆ ತಕ್ಕಂತೆ ನಿಯಮಿತವಲ್ಲದ ಗಾತ್ರ

ಪ್ರಕಾರ: SS 347 ತಡೆರಹಿತ ಪೈಪ್‌ಗಳು |SS 347 ERW ಪೈಪ್ಸ್ |SS 347 ವೆಲ್ಡ್ ಪೈಪ್ಸ್ |SS 347 ಫ್ಯಾಬ್ರಿಕೇಟೆಡ್ ಪೈಪ್ಸ್ |SS 347 CDW ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳು, LSAW ಪೈಪ್ಸ್ / ಸೀಮ್-ವೆಲ್ಡೆಡ್ / ರಿಡ್ರಾನ್

ಫಾರ್ಮ್: SS 347 ರೌಂಡ್ ಪೈಪ್‌ಗಳು/ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳು, SS 347 ಸ್ಕ್ವೇರ್ ಪೈಪ್‌ಗಳು/ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳು, SS 347 ಆಯತಾಕಾರದ ಪೈಪ್/ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳು, SS 347 ಸುರುಳಿಯಾಕಾರದ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳು, SS 347 “U” ಆಕಾರ, SS 347 ಪ್ಯಾನ್ ಕೇಕ್ ಕಾಯಿಲ್ಸ್, Hydraulic 347

ಉದ್ದ: ಏಕ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ, ಡಬಲ್ ರಾಂಡಮ್ ಮತ್ತು ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಉದ್ದದ ಅಂತ್ಯ: ಸರಳ ಅಂತ್ಯ, ಬೆವೆಲ್ಡ್ ಎಂಡ್, ಟ್ರೆಡೆಡ್

ಎಂಡ್ ಪ್ರೊಟೆಕ್ಷನ್: ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಕ್ ಕ್ಯಾಪ್ಸ್ |ಹೊರಗಿನ ಮುಕ್ತಾಯ: 2B, No.4, No.1, No.8 ಸ್ಟೇನ್‌ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ ಪೈಪ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ ಮಿರರ್ ಫಿನಿಶ್, ಗ್ರಾಹಕರ ಅಗತ್ಯತೆಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಮುಕ್ತಾಯಗೊಳಿಸಿ

ವಿತರಣಾ ಸ್ಥಿತಿ: ಅನೆಲ್ಡ್ ಮತ್ತು ಪಿಕಲ್ಡ್, ಪಾಲಿಶ್ಡ್, ಬ್ರೈಟ್ ಅನೆಲ್ಡ್, ಕೋಲ್ಡ್ ಡ್ರಾನ್

ತಪಾಸಣೆ, ಪರೀಕ್ಷಾ ವರದಿಗಳು: ಮಿಲ್ ಟೆಸ್ಟ್ ಪ್ರಮಾಣಪತ್ರಗಳು, EN 10204 3.1, ರಾಸಾಯನಿಕ ವರದಿಗಳು, ಯಾಂತ್ರಿಕ ವರದಿಗಳು, PMI ಪರೀಕ್ಷಾ ವರದಿಗಳು, ವಿಷುಯಲ್ ತಪಾಸಣೆ ವರದಿಗಳು, ಮೂರನೇ ವ್ಯಕ್ತಿಯ ತಪಾಸಣೆ ವರದಿಗಳು, NABL ಅನುಮೋದಿತ ಲ್ಯಾಬ್ ವರದಿಗಳು, ವಿನಾಶಕಾರಿ ಪರೀಕ್ಷಾ ವರದಿ, ನಾನ್ ಡೆಸ್ಟ್ರಕ್ಟಿವ್ ವರದಿಗಳು

ಪ್ಯಾಕಿಂಗ್: ಮರದ ಪೆಟ್ಟಿಗೆಗಳು, ಪ್ಲಾಸ್ಟಿಕ್ ಚೀಲಗಳು, ಸ್ಟೀಲ್ ಸ್ಟ್ರಿಪ್ಸ್ ಬಂಡಲ್, ಅಥವಾ ಗ್ರಾಹಕರ ವಿನಂತಿಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಪ್ಯಾಕ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ

ವಿಶೇಷತೆಗಳು: ಮೇಲಿನ ಹೊರತುಪಡಿಸಿ ಗಾತ್ರಗಳು ಮತ್ತು ವಿಶೇಷಣಗಳನ್ನು ವಿನಂತಿಯ ಮೇರೆಗೆ ತಯಾರಿಸಬಹುದು

SS 347 ಪೈಪ್ ಗಾತ್ರ ಶ್ರೇಣಿ:1/2 ಇಂಚು NB, OD ನಿಂದ 24 ಇಂಚು

ASTM A312 347: ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು ಸಾಮಾನ್ಯ ನಾಶಕಾರಿ ಸೇವೆಗಾಗಿ ಉದ್ದೇಶಿಸಲಾದ ತಡೆರಹಿತ ಮತ್ತು ನೇರ-ಸೀಮ್ ಬೆಸುಗೆ ಹಾಕಿದ ಆಸ್ಟೆನಿಟಿಕ್ ಪೈಪ್.ವೆಲ್ಡಿಂಗ್ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಫಿಲ್ಲರ್ ಲೋಹವನ್ನು ಅನುಮತಿಸಲಾಗುವುದಿಲ್ಲ.

ASTM A358 347: ನಾಶಕಾರಿ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದ ಸೇವೆಗಾಗಿ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಿಕ್ ಫ್ಯೂಷನ್ ವೆಲ್ಡ್ ಆಸ್ಟೆನಿಟಿಕ್ ಪೈಪ್.ವಿಶಿಷ್ಟವಾಗಿ 8 ಇಂಚಿನವರೆಗಿನ ಪೈಪ್ ಅನ್ನು ಮಾತ್ರ ಈ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಗೆ ಉತ್ಪಾದಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ವೆಲ್ಡಿಂಗ್ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಫಿಲ್ಲರ್ ಲೋಹದ ಸೇರ್ಪಡೆಗೆ ಅನುಮತಿ ಇದೆ.

ASTM A790 347: ತಡೆರಹಿತ ಮತ್ತು ನೇರ-ಸೀಮ್ ಬೆಸುಗೆ ಹಾಕಿದ ಫೆರಿಟಿಕ್/ಆಸ್ಟೆನಿಟಿಕ್ (ಡ್ಯುಪ್ಲೆಕ್ಸ್) ಪೈಪ್ ಸಾಮಾನ್ಯ ನಾಶಕಾರಿ ಸೇವೆಗಾಗಿ ಉದ್ದೇಶಿಸಲಾಗಿದೆ, ಒತ್ತಡದ ತುಕ್ಕು ಕ್ರ್ಯಾಕಿಂಗ್‌ಗೆ ಪ್ರತಿರೋಧದ ಮೇಲೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಒತ್ತು ನೀಡಲಾಗುತ್ತದೆ.

ASTM A409 347: ಸ್ಟ್ರೈಟ್-ಸೀಮ್ ಅಥವಾ ಸ್ಪೈರಲ್-ಸೀಮ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಿಕ್ ಫ್ಯೂಷನ್ ವೆಲ್ಡ್ ದೊಡ್ಡ ವ್ಯಾಸದ ಆಸ್ಟೆನಿಟಿಕ್ ಲೈಟ್-ವಾಲ್ ಪೈಪ್ ಅನ್ನು 14" ನಿಂದ 30" ಗಾತ್ರದಲ್ಲಿ Sch5S ಮತ್ತು Sch 10S ಗೋಡೆಗಳೊಂದಿಗೆ ನಾಶಕಾರಿ ಮತ್ತು/ಅಥವಾ ಹೆಚ್ಚಿನ

ASTM A376 347: ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನದ ಅನ್ವಯಗಳಿಗೆ ತಡೆರಹಿತ ಆಸ್ಟೆನಿಟಿಕ್ ಪೈಪ್.

ASTM A813 347: ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು ಸಾಮಾನ್ಯ ನಾಶಕಾರಿ ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ ಏಕ-ಸೀಮ್, ಸಿಂಗಲ್- ಅಥವಾ ಡಬಲ್-ವೆಲ್ಡ್ ಆಸ್ಟೆನಿಟಿಕ್ ಪೈಪ್.

ASTM A814 347: ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನ ಮತ್ತು ಸಾಮಾನ್ಯ ನಾಶಕಾರಿ ಸೇವೆಗಾಗಿ ಶೀತ-ಕೆಲಸದ ಬೆಸುಗೆ ಹಾಕಿದ ಆಸ್ಟೆನಿಟಿಕ್ ಪೈಪ್.

347H ಸ್ಟೇನ್ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ ಪೈಪ್ಸ್ ರಾಸಾಯನಿಕ ಸಂಯೋಜನೆ

ಸ್ಟೇನ್ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ 347H ಪೈಪ್ ಮೆಕ್ಯಾನಿಕಲ್ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು

ಸ್ಟೇನ್ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ 347H ಪೈಪ್ಸ್ ಭೌತಿಕ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು

347H ಸ್ಟೇನ್‌ಲೆಸ್ ಸ್ಟೀಲ್ ಪೈಪ್‌ಗೆ ಸಮಾನ ಶ್ರೇಣಿಗಳು

ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಆಲ್ಫಾ-ಸಿನ್ಯೂಕ್ಲಿನ್ (αS) ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯು ಪಾರ್ಕಿನ್ಸನ್ ಕಾಯಿಲೆ ಮತ್ತು ಇತರ ಸಿನ್ಯೂಕ್ಲಿನೋಪತಿಗಳ ವಿಶಿಷ್ಟ ಲಕ್ಷಣವಾಗಿದೆ.ಇತ್ತೀಚೆಗೆ, ಆಲ್ಝೈಮರ್ನ ಕಾಯಿಲೆಯೊಂದಿಗೆ ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಸಂಬಂಧಿಸಿರುವ ಟೌ ಪ್ರೊಟೀನ್ αS ರೋಗಶಾಸ್ತ್ರದೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದೆ ಮತ್ತು αS- ಸಮೃದ್ಧ ಸೇರ್ಪಡೆಗಳಲ್ಲಿ ಸಹ-ಸ್ಥಳೀಕರಣವನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿದಿದೆ, ಆದಾಗ್ಯೂ ಎರಡು ಪ್ರೋಟೀನ್ಗಳ ಘನೀಕರಣದ ಆಣ್ವಿಕ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವು ಅಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿದೆ.ಟೌ ನಂತಹ ಧನಾತ್ಮಕ ಆವೇಶದ ಪಾಲಿಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಸಂಕೀರ್ಣ ಘನೀಕರಣದ ಮೂಲಕ αS ಹಂತವು ದ್ರವ ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ಗಳಾಗಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ.ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳಿಗೆ αS ನ ಸಂಬಂಧ ಮತ್ತು ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟುವಿಕೆ ಜಾಲದ ವೇಲೆನ್ಸಿ ಸವಕಳಿಯ ದರವನ್ನು ಅವಲಂಬಿಸಿ, ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟುವಿಕೆಗಳು ಕ್ಷಿಪ್ರ ಜಿಲೇಶನ್ ಅಥವಾ ಒಗ್ಗೂಡುವಿಕೆಗೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ನಂತರ ನಿಧಾನವಾದ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಗೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತವೆ.ಸುಧಾರಿತ ಜೈವಿಕ ಭೌತಶಾಸ್ತ್ರದ ತಂತ್ರಗಳ ಸೂಟ್ ಅನ್ನು ಸಂಯೋಜಿಸುವ ಮೂಲಕ, ನಾವು ದ್ರವ-ದ್ರವ αS/Tau ಹಂತದ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು ಮತ್ತು ದ್ರವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಎರಡೂ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ವೈವಿಧ್ಯಮಯ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳ ರಚನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ಪ್ರಮುಖ ಅಂಶಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು.
ಮೆಂಬರೇನ್ ವಿಭಾಗಗಳ ಜೊತೆಗೆ, ದ್ರವ-ದ್ರವ ಹಂತದ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆ (LLPS) ಎಂದು ಕರೆಯಲ್ಪಡುವ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಮೂಲಕ ಜೈವಿಕ ಅಣು ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಹನಿಗಳು ಎಂದು ಕರೆಯಲ್ಪಡುವ ಪ್ರೋಟೀನ್-ಸಮೃದ್ಧ, ದ್ರವ-ತರಹದ ದಟ್ಟವಾದ ಕಾಯಗಳ ರಚನೆಯ ಮೂಲಕ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿನ ಪ್ರಾದೇಶಿಕ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯನ್ನು ಸಾಧಿಸಬಹುದು.ಈ ಹನಿಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗಳ ನಡುವಿನ ಬಹುವೇಲೆಂಟ್ ತಾತ್ಕಾಲಿಕ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳಿಂದ ರೂಪುಗೊಳ್ಳುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಬಹುತೇಕ ಎಲ್ಲಾ ಜೀವನ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳಲ್ಲಿ ವಿವಿಧ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತವೆ.ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಎಲ್‌ಎಲ್‌ಪಿ-ಸಾಮರ್ಥ್ಯದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಕಡಿಮೆ ಸಂಕೀರ್ಣತೆಯ ಅನುಕ್ರಮಗಳನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತವೆ, ಅದು ಪ್ರಕೃತಿಯಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಅಸ್ತವ್ಯಸ್ತವಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಜೈವಿಕ ಅಣು ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ಗಳ ರಚನೆಯಲ್ಲಿ 3,4,5.ಹಲವಾರು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ಈ ದ್ರವ-ತರಹದ ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುವ, ಆಗಾಗ್ಗೆ ಅಸ್ತವ್ಯಸ್ತವಾಗಿರುವ ಮತ್ತು ಬಹುವೇಲೆಂಟ್ ಸ್ವರೂಪವನ್ನು ಬಹಿರಂಗಪಡಿಸಿವೆ, ಆದರೂ ಈ ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ಗಳ ಬೆಳವಣಿಗೆ ಮತ್ತು ಪಕ್ವತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ಘನ-ತರಹಕ್ಕೆ ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಆಣ್ವಿಕ ನಿರ್ಣಾಯಕಗಳ ಬಗ್ಗೆ ಸ್ವಲ್ಪವೇ ತಿಳಿದಿದೆ. ರಾಜ್ಯ..
ಹೊಸ ದತ್ತಾಂಶವು ಅಸಹಜವಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್-ಚಾಲಿತ ಎಲ್‌ಎಲ್‌ಪಿಎಸ್ ಮತ್ತು ಹನಿಗಳನ್ನು ಘನ ರಚನೆಗಳಾಗಿ ಪರಿವರ್ತಿಸುವುದು ಸಂಬಂಧಿತ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಮಾರ್ಗಗಳಾಗಿರಬಹುದು, ಇದು ಕರಗದ ವಿಷಕಾರಿ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳ ರಚನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಕ್ಷೀಣಗೊಳ್ಳುವ ಕಾಯಿಲೆಗಳ ವಿಶಿಷ್ಟ ಲಕ್ಷಣಗಳಾಗಿವೆ.ಅನೇಕ LLPS-ಸಂಬಂಧಿತ ಆಂತರಿಕವಾಗಿ ಅಸ್ತವ್ಯಸ್ತವಾಗಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು (IDP ಗಳು), ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚು ಚಾರ್ಜ್ ಆಗುವ ಮತ್ತು ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುವ, ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಮೂಲಕ ನರ ವಿಘಟನೆಯೊಂದಿಗೆ ದೀರ್ಘಕಾಲ ಸಂಬಂಧಿಸಿವೆ.ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, FUS7 ಅಥವಾ TDP-438 ನಂತಹ ಜೈವಿಕ ಅಣುಗಳ IDP ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ಗಳು ಅಥವಾ hnRNPA19 ನಂತಹ ದೊಡ್ಡ ಕಡಿಮೆ ಸಂಕೀರ್ಣತೆಯ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ದ್ರವೀಕರಣ ಎಂಬ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಮೂಲಕ ಜೆಲ್ ತರಹದ ಅಥವಾ ಘನ ರೂಪಗಳಾಗಿ ವಯಸ್ಸಾಗುತ್ತವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಸಂಯುಕ್ತ.ಘನ ಹಂತದ ಪರಿವರ್ತನೆಗೆ (LSPT) ಸಮಯದ ಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ ಅಥವಾ ಕೆಲವು ಅನುವಾದ-ನಂತರದ ಮಾರ್ಪಾಡುಗಳಿಗೆ ಅಥವಾ ರೋಗಶಾಸ್ತ್ರೀಯವಾಗಿ ಮಹತ್ವದ ರೂಪಾಂತರಗಳಿಗೆ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿ1,7.
ವಿವೋದಲ್ಲಿನ ಎಲ್‌ಎಲ್‌ಪಿಎಸ್‌ಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಮತ್ತೊಂದು ಐಡಿಪಿಯು ಟೌ, ಮೈಕ್ರೊಟ್ಯೂಬುಲ್-ಸಂಬಂಧಿತ ಅಸ್ತವ್ಯಸ್ತವಾಗಿರುವ ಪ್ರೊಟೀನ್, ಇದರ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯು ಆಲ್ಝೈಮರ್ನ ಕಾಯಿಲೆಯಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿದೆ10 ಆದರೆ ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ಪಾರ್ಕಿನ್ಸನ್ ಕಾಯಿಲೆ (ಪಿಡಿ) ಮತ್ತು ಇತರ ಸಿನಾಪ್ಟಿಕ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯರ್ ಪ್ರೋಟೀನೋಪತಿಗಳು 11, 12, 13 ಸಂಬಂಧಿತವಾಗಿವೆ.ಅನುಕೂಲಕರವಾದ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ ಟೌ ಸ್ವಯಂಪ್ರೇರಿತವಾಗಿ ಪರಿಹಾರ/ಸೈಟೋಪ್ಲಾಸಂನಿಂದ ವಿಯೋಜಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಈ ರೀತಿಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯು ಪ್ರಕೃತಿಯಲ್ಲಿನ ಅನೇಕ ಜೈವಿಕ ಅಣು ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ಗಳ ಹಿಂದಿನ ಪ್ರೇರಕ ಶಕ್ತಿಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ.ಟೌ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಸರಳವಾದ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯಿಂದ ರಚಿಸಬಹುದು, ಇದರಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ ಚಾರ್ಜ್ ಮಾಡಿದ ಪ್ರದೇಶಗಳು ಸೀಳು ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸುತ್ತದೆ, ಅಥವಾ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯಂತಹ ಋಣಾತ್ಮಕ ಆವೇಶದ ಪಾಲಿಮರ್‌ಗಳೊಂದಿಗಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ಮೂಲಕ ಸಂಕೀರ್ಣ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯಿಂದ.
ಇತ್ತೀಚೆಗೆ, α-ಸಿನ್ಯೂಕ್ಲೀನ್ (αS), PD ಮತ್ತು ಇತರ ನ್ಯೂರೋ ಡಿಜೆನೆರೇಟಿವ್ ಕಾಯಿಲೆಗಳಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ IDP ಅನ್ನು ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ ಸಿನ್ಯೂಕ್ಲಿನೋಪತಿ 17,18 ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಮತ್ತು ಪ್ರಾಣಿ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ 19,20 ದ್ರವದಂತಹ ನಡವಳಿಕೆಯೊಂದಿಗೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರೀಕೃತವಾಗಿದೆ.ಪ್ರಧಾನವಾಗಿ ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಸಂವಹನಗಳ ಮೂಲಕ ಸರಳವಾದ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯಿಂದ αS LLPS ಗೆ ಒಳಗಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ವಿಟ್ರೊ ಅಧ್ಯಯನಗಳು ತೋರಿಸಿವೆ, ಆದಾಗ್ಯೂ ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗೆ ಅಸಾಧಾರಣವಾದ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳು ಮತ್ತು ವಿಲಕ್ಷಣವಾಗಿ ದೀರ್ಘವಾದ ಕಾವು ಸಮಯಗಳು 19,21 ಅಗತ್ಯವಿರುತ್ತದೆ.ವಿವೋದಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಲಾದ αS-ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ಗಳು ಇದರಿಂದ ಅಥವಾ ಇತರ LLPS ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳಿಂದ ರೂಪುಗೊಂಡಿವೆಯೇ ಎಂಬುದು ಪರಿಹರಿಸಲಾಗದ ಪ್ರಮುಖ ಸಮಸ್ಯೆಯಾಗಿ ಉಳಿದಿದೆ.ಅಂತೆಯೇ, PD ಮತ್ತು ಇತರ ಸಿನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೊಪತಿಗಳಲ್ಲಿನ ನ್ಯೂರಾನ್‌ಗಳಲ್ಲಿ αS ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆಯಾದರೂ, αS ಅಂತರ್ಜೀವಕೋಶದ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಗೆ ಒಳಗಾಗುವ ನಿಖರವಾದ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವು ಅಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿಯೇ ಉಳಿದಿದೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಈ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಅತಿಯಾದ ಒತ್ತಡವು ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಸ್ವತಃ ಪ್ರಚೋದಿಸುತ್ತದೆ.ಜೀವಕೋಶದೊಳಗಿನ αS ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಅಸೆಂಬ್ಲಿಗಳ ಮರುಕಳಿಸುವಿಕೆಗೆ ಕೆಲವು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಸ್ಥಳಗಳು ಅಥವಾ ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಪರಿಸರಗಳು ಅಗತ್ಯವೆಂದು ಸೂಚಿಸುವ ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಹಾನಿಯು ಆಗಾಗ್ಗೆ ಅಗತ್ಯವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಗೆ ಒಳಗಾಗುವ ಒಂದು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಪರಿಸರವು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್ಗಳ ಒಳಭಾಗವಾಗಿರಬಹುದು 23 .
ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಪಾರ್ಕಿನ್ಸನ್ ಕಾಯಿಲೆ ಮತ್ತು ಇತರ ಸಿನ್ಯೂಕ್ಲಿನೋಪತಿಗಳು 24,25 ನೊಂದಿಗೆ ಮಾನವರಲ್ಲಿ ವಿಶಿಷ್ಟ ರೋಗ ಸೇರ್ಪಡೆಗಳಲ್ಲಿ αS ಮತ್ತು ಟೌ ಸಹ-ಸ್ಥಳೀಕರಣವನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರಯೋಗಗಳು ಎರಡು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಸಿನರ್ಜಿಸ್ಟಿಕ್ ರೋಗಶಾಸ್ತ್ರೀಯ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ವರದಿ ಮಾಡಿದೆ 26,27 ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆ αS ಮತ್ತು ನಡುವಿನ ಸಂಭಾವ್ಯ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ನ್ಯೂರೋ ಡಿಜೆನೆರೇಟಿವ್ ಕಾಯಿಲೆಗಳಲ್ಲಿ ಟೌ.ಅನಾರೋಗ್ಯ.αS ಮತ್ತು ಟೌ ವಿಟ್ರೊ ಮತ್ತು ವಿವೋ 28,29 ರಲ್ಲಿ ಪರಸ್ಪರರ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಸಂವಹಿಸಲು ಮತ್ತು ಉತ್ತೇಜಿಸಲು ಕಂಡುಬಂದಿದೆ ಮತ್ತು ಈ ಎರಡು ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳಿಂದ ರಚಿತವಾದ ವೈವಿಧ್ಯಮಯ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳನ್ನು ಸಿನ್ಯೂಕ್ಲಿನೋಪತಿಯ ರೋಗಿಗಳ ಮೆದುಳಿನಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ 30 .ಆದಾಗ್ಯೂ, αS ಮತ್ತು ಟೌ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ಆಣ್ವಿಕ ಆಧಾರ ಮತ್ತು ಅದರ ಸಹ-ಸಂಗ್ರಹಣೆಯ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನದ ಬಗ್ಗೆ ಸ್ವಲ್ಪವೇ ತಿಳಿದಿದೆ.αS ನ ಹೆಚ್ಚು ಋಣಾತ್ಮಕ ಆವೇಶದ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರದೇಶ ಮತ್ತು ಟೌನ ಕೇಂದ್ರ ಪ್ರೋಲಿನ್-ಸಮೃದ್ಧ ಪ್ರದೇಶದ ನಡುವಿನ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಆಕರ್ಷಣೆಯ ಮೂಲಕ ಟೌ ಜೊತೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ವರದಿಯಾಗಿದೆ, ಇದು ಧನಾತ್ಮಕ ಆವೇಶದ ಅವಶೇಷಗಳಿಂದ ಕೂಡಿದೆ.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ, ಪಾಲಿ-ಎಲ್-ಲೈಸಿನ್ (pLK) ನಂತಹ ಇತರ ಧನಾತ್ಮಕ ಆವೇಶದ ಪಾಲಿಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳೊಂದಿಗಿನ ಅದರ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, ಟೌ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಸಂಕೀರ್ಣ ಘನೀಕರಣದ ಮೂಲಕ αS ನಿಜವಾಗಿಯೂ ಹನಿಗಳಾಗಿ ವಿಯೋಜಿಸಬಹುದೆಂದು ನಾವು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ ಮತ್ತು ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ .αS ಡ್ರಾಪ್ಲೆಟ್ ನೆಟ್ವರ್ಕ್ಗಾಗಿ ಸ್ಕ್ಯಾಫೋಲ್ಡ್ ಅಣುವಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ.ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ αS ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳ ಪಕ್ವತೆಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ನಾವು ಗಮನಾರ್ಹ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಕೋಸರ್ವೇಟ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ನಲ್ಲಿ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ವೇಲೆನ್ಸಿ ಮತ್ತು ಬಲದಲ್ಲಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧ ಹೊಂದಿದೆ.ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ದೀರ್ಘಾವಧಿಯ ದ್ರವ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ αS ಮತ್ತು ಟೌ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಸಹ-ಒಗ್ಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು ಅಂತಹ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಈ ಎರಡು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಸಹ-ಸಂಗ್ರಹಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುವ ಕೆಲವು ಪ್ರಮುಖ ಅಂಶಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಇಲ್ಲಿ ನಾವು ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ವಿವರವಾಗಿ ವಿವರಿಸುತ್ತೇವೆ, ಇದು ರೋಗ-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಸೇರ್ಪಡೆಗಳಲ್ಲಿ ಎರಡು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಕೊಲೊಕಲೈಸೇಶನ್‌ಗೆ ಆಧಾರವಾಗಿರುವ ಸಂಭವನೀಯ ಆಣ್ವಿಕ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವಾಗಿದೆ.
αS ತಟಸ್ಥ pH (Fig. 1a) ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಅಯಾನಿಕ್ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಬಾಲವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಮತ್ತು ಪಾಲಿಕೇಶನ್ ಡಿಸಾರ್ಡರ್ಡ್ ಪಾಲಿಪೆಪ್ಟೈಡ್ ಅಣುಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ಘನೀಕರಣದ ಮೂಲಕ LLPS ಗೆ ಒಳಗಾಗಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸಿದ್ದೇವೆ.ತಟಸ್ಥ pH 32 ನಲ್ಲಿ ಧನಾತ್ಮಕ ಆವೇಶದ ಮತ್ತು ಅಸ್ತವ್ಯಸ್ತವಾಗಿರುವ ಪಾಲಿಮರಿಕ್ ಸ್ವಭಾವದಿಂದಾಗಿ ನಾವು 100-ಅವಶೇಷ ಪಾಲಿ-L-ಲೈಸಿನ್ (pLK) ಅನ್ನು ಆರಂಭಿಕ ಮಾದರಿಯ ಅಣುವಾಗಿ ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ. ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, ಪರಿಹಾರ NMR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ಮೂಲಕ pLK αS ನ Ct ಡೊಮೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಖಚಿತಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ. (ಚಿತ್ರ 1b) ಹೆಚ್ಚುತ್ತಿರುವ αS:pLK ಮೋಲಾರ್ ಅನುಪಾತಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ 13C/15N-ಲೇಬಲ್ αS ಅನ್ನು ಬಳಸುವುದು.αS ನ Ct-ಡೊಮೈನ್‌ನೊಂದಿಗೆ pLK ಯ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯು ರಾಸಾಯನಿಕ ಬದಲಾವಣೆಯ ಪ್ರಕ್ಷುಬ್ಧತೆಗಳಲ್ಲಿ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಈ ಪ್ರದೇಶದಲ್ಲಿನ ಗರಿಷ್ಠ ತೀವ್ರತೆಯ ಇಳಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಸ್ವತಃ ಪ್ರಕಟವಾಗುತ್ತದೆ.ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ನಾವು pLK ಜೊತೆಗೆ αS ಅನ್ನು ಸುಮಾರು αS ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಬೆರೆಸಿದಾಗ.ಪಾಲಿಥಿಲೀನ್ ಗ್ಲೈಕಾಲ್ (5-15% PEG-8) ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ 5-25 µM (ವಿಶಿಷ್ಟ LLPS ಬಫರ್: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) ನಾವು ತಕ್ಷಣವೇ ಪ್ರೋಟೀನ್ ರಚನೆಯ ವಿಶಾಲ ಕ್ಷೇತ್ರದ ಮೂಲಕ ಹೋದೆವು. .ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ (WF) ಮತ್ತು ಬ್ರೈಟ್-ಫೀಲ್ಡ್ (BF) ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (Fig. 1c) ಬಳಸಿ ಹನಿಗಳನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ.ಕೇಂದ್ರೀಕೃತ αS ಹೊಂದಿರುವ 1-5 µm ಹನಿಗಳು (1 µM ಅಲೆಕ್ಸಾಫ್ಲುರ್ 488-ಲೇಬಲ್ αS, AF488-αS ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ), ಅವುಗಳ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಅವುಗಳ ಪ್ರತಿರೋಧದಿಂದ 10% 1,6-ಹೆಕ್ಸಾನೆಡಿಯೋಲ್ (1,6-HD) ಗೆ ಮತ್ತು ಅದರ NaCl ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಹೆಚ್ಚಳ (Fig. 1c).αS/pLK ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಸಂಕೀರ್ಣದ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳ ದ್ರವ-ತರಹದ ಸ್ವಭಾವವು ಮಿಲಿಸೆಕೆಂಡ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (Fig. 1d) ಬೆಸೆಯುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದಿಂದ ನಿರೂಪಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ.ಟರ್ಬಿಡಿಮೆಟ್ರಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ನಾವು ಈ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಹನಿಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಅದರ ಸ್ಥಿರತೆಗೆ (Fig. 1e) ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಮುಖ್ಯ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಸ್ವರೂಪವನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು LLPS ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಮೇಲೆ ವಿವಿಧ ಪಾಲಿಮರ್ ಅನುಪಾತಗಳ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ (Fig. 1f).ವ್ಯಾಪಕ ಶ್ರೇಣಿಯ ಪಾಲಿಮರ್ ಅನುಪಾತಗಳಲ್ಲಿ ಹನಿಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ಗಮನಿಸಿದರೂ, pLK αS ಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿರುವಾಗ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ತುಂಬಾ ಅನುಕೂಲಕರವಾಗಿರುತ್ತದೆ.LLP ಗಳನ್ನು ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ವಿಭಿನ್ನ ಸ್ಥಳಾಂತರ ಏಜೆಂಟ್ ಡೆಕ್ಸ್ಟ್ರಾನ್-70 (70 kDa) ಬಳಸಿ ಅಥವಾ ಗಾಜಿನ ಸ್ಲೈಡ್ ಡ್ರಾಪ್‌ಗಳು, ವಿವಿಧ ವಸ್ತುಗಳ ಮೈಕ್ರೊಪ್ಲೇಟ್ ಬಾವಿಗಳು, ಎಪ್ಪೆಂಡಾರ್ಫ್ ಅಥವಾ ಕ್ವಾರ್ಟ್ಜ್ ಕ್ಯಾಪಿಲ್ಲರಿಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಂತೆ ವಿವಿಧ ಮಾದರಿ ಸ್ವರೂಪಗಳನ್ನು ಬಳಸುವುದನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ WT-αS ಮತ್ತು ΔCt-αS ರೂಪಾಂತರಗಳಲ್ಲಿನ ವಿವಿಧ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪ್ರದೇಶಗಳ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯ.ಆಂಫಿಪಾಥಿಕ್ ಎನ್-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಡೊಮೇನ್, ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್-ಫಾರ್ಮಿಂಗ್ (ಎನ್‌ಎಸಿ) ಪ್ರದೇಶ ಮತ್ತು ಋಣಾತ್ಮಕ ಆವೇಶದ ಸಿ-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಡೊಮೇನ್ ಅನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ ನೀಲಿ, ಕಿತ್ತಳೆ ಮತ್ತು ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣಗಳಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.WT-αS ನ ನಿವ್ವಳ ಶುಲ್ಕ ಪ್ರತಿ ಉಳಿದ (NCPR) ನಕ್ಷೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.b ಮ್ಯಾಕ್ರೋಮಾಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಕ್ಲಂಪ್‌ಗಳ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ αS/pLK ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ NMR ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ.pLK ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಹೆಚ್ಚಾದಂತೆ (αS: 1:0.5, 1:1.5, ಮತ್ತು 1:10 ರ pLK ಮೋಲಾರ್ ಅನುಪಾತಗಳು ಕ್ರಮವಾಗಿ ತಿಳಿ ಹಸಿರು, ಹಸಿರು ಮತ್ತು ಕಡು ಹಸಿರು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ).c Coacervate αS/pLK (ಮೋಲಾರ್ ಅನುಪಾತ 1:10) 25 µM ನಲ್ಲಿ (1 µM AF488-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ αS ಅಥವಾ WF ಇಮೇಜಿಂಗ್‌ಗಾಗಿ Atto647N-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ pLK) LLPS ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ (ಮೇಲ್ಭಾಗ) ಅಥವಾ NaCl ನಂತರ 500 ಮಿಮೀ ಬಿಟ್ಟು % 1,6-ಹೆಕ್ಸಾನೆಡಿಯೋಲ್ (1,6-HD; ಕೆಳಗಿನ ಬಲ).ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ = 20 µm.d 25 μM ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ αS/pLK (ಮೋಲಾರ್ ಅನುಪಾತ 1:10) ನ BF ಡ್ರಾಲೆಟ್ ಸಮ್ಮಿಳನದ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕ ಚಿತ್ರಗಳು;ಬಾಣಗಳು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಹನಿಗಳನ್ನು (ಕೆಂಪು ಮತ್ತು ಹಳದಿ ಬಾಣಗಳು) ಹೊಸ ಡ್ರಾಪ್ (ಕಿತ್ತಳೆ ಬಾಣ) 200 ms ಒಳಗೆ ವಿಲೀನಗೊಳಿಸುವುದನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ) .ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ = 20 µm.25 µM αS ನಲ್ಲಿ 500 mM NaCl ಅಥವಾ 10% 1,6-HD ಅನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೊದಲು ಮತ್ತು ನಂತರ LLPS ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ e ಲೈಟ್ ಸ್ಕ್ಯಾಟರಿಂಗ್ (350 nm ನಲ್ಲಿ) αS/pLK ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆ (N = 3 ಮಾದರಿ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳು, ಸರಾಸರಿ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವನ್ನು ಸಹ ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ).f BF ಚಿತ್ರ (ಮೇಲ್ಭಾಗ) ಮತ್ತು ಬೆಳಕಿನ ಸ್ಕ್ಯಾಟರಿಂಗ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (350 nm ನಲ್ಲಿ, ಕೆಳಭಾಗದಲ್ಲಿ) 25 μM αS ನಲ್ಲಿ αS/pLK ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆ αS: pLK ಮೋಲಾರ್ ಅನುಪಾತವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವುದರೊಂದಿಗೆ (N = 3 ಮಾದರಿ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳು, ಸರಾಸರಿ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವನ್ನು ಸಹ ಸೂಚಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ).ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ = 10 µm.ಒಂದು ಚಿತ್ರದ ಮೇಲಿನ ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ ಒಂದು ಪ್ಯಾನೆಲ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಎಲ್ಲಾ ಚಿತ್ರಗಳ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾವನ್ನು ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾ ಫೈಲ್‌ಗಳ ರೂಪದಲ್ಲಿ ಒದಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
αS/pLK ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಸಂಕೀರ್ಣ ಘನೀಕರಣದ ನಮ್ಮ ಅವಲೋಕನಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಮತ್ತು tau31 ನೊಂದಿಗೆ ನೇರ ಸಂವಾದದ ಮೂಲಕ tau/RNA ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ನ ಕ್ಲೈಂಟ್ ಅಣುವಾಗಿ αS ನ ಹಿಂದಿನ ಅವಲೋಕನಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ, αS ಮತ್ತು tau ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ದ್ರಾವಕದೊಂದಿಗೆ ಸಹ-ಬೇರ್ಪಡಿಸಬಹುದು ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಘನೀಕರಣ.ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಸಂಕೀರ್ಣಗಳ ಮೂಲಕ, ಮತ್ತು αS ಎಂಬುದು αS/ಟೌ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ಕ್ಯಾಫೋಲ್ಡ್ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಆಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 2e ನಲ್ಲಿ ಟೌ ಚಾರ್ಜ್ ವಿತರಣೆಯನ್ನು ನೋಡಿ).LLPS ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 10 μM αS ಮತ್ತು 10 μM Tau441 (ಕ್ರಮವಾಗಿ 1 μM AF488-αS ಮತ್ತು 1 μM Atto647N-Tau ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ) ಒಟ್ಟಿಗೆ ಬೆರೆಸಿದಾಗ, WF ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ನೋಡಿದಂತೆ ಅವು ಎರಡೂ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳನ್ನು ಸುಲಭವಾಗಿ ರೂಪಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ.(ಚಿತ್ರ 2a).ಹನಿಗಳಲ್ಲಿನ ಎರಡು ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳ ಕೊಲೊಕಲೈಸೇಶನ್ ಅನ್ನು ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ (CF) ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗ್. 1a) ಮೂಲಕ ದೃಢೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಡೆಕ್ಸ್ಟ್ರಾನ್-70 ಅನ್ನು ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯ ಏಜೆಂಟ್ ಆಗಿ ಬಳಸಿದಾಗ ಇದೇ ರೀತಿಯ ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 1c).FITC-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ PEG ಅಥವಾ ಡೆಕ್ಸ್ಟ್ರಾನ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು, ಎರಡೂ ಗುಂಪಿನ ಏಜೆಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಮಾದರಿಗಳಾದ್ಯಂತ ಸಮವಾಗಿ ವಿತರಿಸಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆ ಅಥವಾ ಸಹಭಾಗಿತ್ವವನ್ನು ತೋರಿಸುವುದಿಲ್ಲ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 1d).ಬದಲಿಗೆ, ಈ ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ ಅವರು ಮ್ಯಾಕ್ರೋಮಾಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಕ್ರೌಡಿಂಗ್ ಎಫೆಕ್ಟ್‌ಗಳ ಮೂಲಕ ಹಂತದ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆಯನ್ನು ಉತ್ತೇಜಿಸುತ್ತಾರೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ, ಏಕೆಂದರೆ PEG ಇತರ LLP ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವಂತೆ, PEG ಆದ್ಯತೆಯ ಸ್ಥಿರವಾದ ಜನಸಂದಣಿ ಏಜೆಂಟ್ ಆಗಿದೆ.ಈ ಪ್ರೊಟೀನ್-ಸಮೃದ್ಧ ಹನಿಗಳು NaCl (1 M) ಗೆ ಸಂವೇದನಾಶೀಲವಾಗಿರುತ್ತವೆ ಆದರೆ 1,6-HD (10% v/v) ಗೆ ಅಲ್ಲ, ಅವುಗಳ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸುತ್ತವೆ (ಪೂರಕ Fig. 2a, b).BF ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕವನ್ನು (Fig. 2b) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮಿಲಿಸೆಕೆಂಡ್ ವಿಲೀನಗೊಳಿಸುವ ಹನಿ ಘಟನೆಗಳನ್ನು ಗಮನಿಸುವುದರ ಮೂಲಕ ಅವರ ದ್ರವ ವರ್ತನೆಯನ್ನು ದೃಢೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.
LLPS ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿನ αS/Tau441 ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ (CF) ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ಚಿತ್ರಗಳು (ಪ್ರತಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ 10 μM, AF488-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ αS ನ 0.5 μM ಮತ್ತು Atto647N-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ Tau441).b ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುವ ಡಿಫರೆನ್ಷಿಯಲ್ ಇಂಟರ್‌ಫರೆನ್ಸ್ ಕಾಂಟ್ರಾಸ್ಟ್ (DIC) ಚಿತ್ರಗಳು αS/Tau441 ಹನಿ ಸಮ್ಮಿಳನ ಘಟನೆಗಳು (ಪ್ರತಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗೆ 10 μM).c 50 µM αS ನ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ (ಎಡ) ಅಥವಾ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ (ಬಲ) Tau441 LLPS (0–15 µM) ನ ಬೆಳಕಿನ ಸ್ಕ್ಯಾಟರಿಂಗ್ (350 nm ನಲ್ಲಿ) ಆಧಾರಿತ ಹಂತದ ರೇಖಾಚಿತ್ರ.ಬೆಚ್ಚಗಿನ ಬಣ್ಣಗಳು ಹೆಚ್ಚು ಚದುರುವಿಕೆಯನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.d ಹೆಚ್ಚುತ್ತಿರುವ αS ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ αS/Tau441 LLPS ಮಾದರಿಗಳ ಬೆಳಕಿನ ಸ್ಕ್ಯಾಟರಿಂಗ್ (Tau441 at 5 µM, N = 2-3 ಮಾದರಿ ಪುನರಾವರ್ತನೆಗಳು ಸೂಚಿಸಿದಂತೆ).ಇ ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಕೆಲವು ಟೌ ಪ್ರೋಟೀನ್ ರೂಪಾಂತರಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ವಿವಿಧ ಪ್ರದೇಶಗಳ ಸ್ಕೀಮ್ಯಾಟಿಕ್ ಪ್ರಾತಿನಿಧ್ಯ: ಋಣಾತ್ಮಕ ಚಾರ್ಜ್ಡ್ ಎನ್-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಡೊಮೇನ್ (ಕೆಂಪು), ಪ್ರೋಲಿನ್-ಸಮೃದ್ಧ ಪ್ರದೇಶ (ನೀಲಿ), ಮೈಕ್ರೊಟ್ಯೂಬ್ಯೂಲ್-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಡೊಮೇನ್ (MTBD, ಕಿತ್ತಳೆ ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ಹೈಲೈಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ) ಮತ್ತು ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್-ರೂಪಿಸುವ ಜೋಡಿ ಸುರುಳಿ.ತಂತು ಪ್ರದೇಶಗಳು (PHF) MTBD (ಬೂದು) ಒಳಗೆ ಇದೆ.Tau441 ನ ನಿವ್ವಳ ಶುಲ್ಕ ಪ್ರತಿ ರೆಸಿಡ್ಯೂ (NCPR) ನಕ್ಷೆಯನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.f 1 µM AF488-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ αS ಮತ್ತು Atto647N-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ΔNt-, 1 µM AF488-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ αS ಅಥವಾ ΔCt-αS ಅನ್ನು ΔNt-Tau ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಬಳಸುವುದು (ಮೇಲ್ಭಾಗ, 10 µ0 ಪ್ರತಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗೆ (ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗೆ 10 µ5) ) ) LLPS ಅಥವಾ K18 ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಘನೀಕರಿಸಿದ WF ನ ಮೈಕ್ರೋಗ್ರಾಫ್‌ಗಳು.ಒಂದು ಚಿತ್ರದಲ್ಲಿನ ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್‌ಗಳು ಒಂದು ಪ್ಯಾನೆಲ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಎಲ್ಲಾ ಚಿತ್ರಗಳ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ (ಪ್ಯಾನಲ್‌ಗಳಿಗೆ 20 µm a, b ಮತ್ತು f).ಸಿ ಮತ್ತು ಡಿ ಪ್ಯಾನೆಲ್‌ಗಳಿಗೆ ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾವನ್ನು ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾ ಫೈಲ್‌ಗಳಾಗಿ ಒದಗಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಈ LLPS ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ αS ನ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, NaCl (Fig. 2c) ನ ಹೆಚ್ಚುತ್ತಿರುವ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನೆಫೆಲೋಮೆಟ್ರಿಯಿಂದ ಹನಿಗಳ ಸ್ಥಿರತೆಯ ಮೇಲೆ αS ನ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ನಾವು ಮೊದಲು ತನಿಖೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ.αS ಹೊಂದಿರುವ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಉಪ್ಪಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯು, ಬೆಳಕಿನ ಸ್ಕ್ಯಾಟರಿಂಗ್ ಮೌಲ್ಯಗಳು (350 nm ನಲ್ಲಿ), ಈ LLPS ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ αS ನ ಸ್ಥಿರಗೊಳಿಸುವ ಪಾತ್ರವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.αS ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು (ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ αS:Tau441 ಅನುಪಾತ) ಹೆಚ್ಚಿಸುವ ಮೂಲಕ ಇದೇ ರೀತಿಯ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಗಮನಿಸಬಹುದು.ಟೌ ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ (5 µM) ಹೋಲಿಸಿದರೆ 10-ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚಳ (Fig. 2d).ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ αS ಒಂದು ಸ್ಕ್ಯಾಫೋಲ್ಡ್ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಎಂಬುದನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲು, ನಾವು ಎಲ್‌ಎಲ್‌ಪಿಎಸ್-ಅಸ್ತವ್ಯಸ್ತಗೊಂಡ ಟೌ ಮ್ಯುಟೆಂಟ್‌ನ ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡಲು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಋಣಾತ್ಮಕ ಆವೇಶದ N-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವುದಿಲ್ಲ (ಉಳಿಕೆಗಳು 1-150, ಚಿತ್ರ 2e ನೋಡಿ) ΔNt-Tau ಎಂದು ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ.WF ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕ ಮತ್ತು ನೆಫೆಲೋಮೆಟ್ರಿಯು ΔNt-Tau ಸ್ವತಃ LLPS (Fig. 2f ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 2d) ಗೆ ಒಳಗಾಗಲಿಲ್ಲ ಎಂದು ದೃಢಪಡಿಸಿದೆ, 14. ಆದಾಗ್ಯೂ, ಈ ಮೊಟಕುಗೊಳಿಸಿದ Tau ರೂಪಾಂತರದ ಪ್ರಸರಣ ಪರಿಹಾರಗಳಿಗೆ αS ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಿದಾಗ, LLPS ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಆಗಿತ್ತು. ಟೌ ಮತ್ತು αS ನ ಪೂರ್ಣ-ಗಾತ್ರದ ಪರಿಹಾರಗಳ ಸಣ್ಣಹನಿಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ ಹತ್ತಿರವಿರುವ ಸಣ್ಣಹನಿಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಮರುಸ್ಥಾಪಿಸಲಾಗಿದೆ ಇದೇ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ.ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮ್ಯಾಕ್ರೋಮಾಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಜನಸಂದಣಿಯ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಸಹ ವೀಕ್ಷಿಸಬಹುದು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 2c).ಎಲ್‌ಎಲ್‌ಪಿಎಸ್ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಸಿ-ಟರ್ಮಿನಲ್ αS ಪ್ರದೇಶದ ಪಾತ್ರ, ಆದರೆ ಅದರ ಸಂಪೂರ್ಣ ಉದ್ದವಲ್ಲ, ಸಿ-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಮೊಟಕುಗೊಳಿಸಿದ αS ರೂಪಾಂತರವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸಣ್ಣಹನಿಯಿಂದ ರಚನೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಂಧಿಸುವ ಮೂಲಕ (ΔCt- 104-140) (Fig. 1a) ಕೊರತೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲಾಯಿತು. αS) ಪ್ರೋಟೀನ್ (Fig. 2f ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 2d).αS ಮತ್ತು ΔNt-Tau ನ ಕೊಲೊಕಲೈಸೇಶನ್ ಅನ್ನು ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗ್. 1b) ಮೂಲಕ ದೃಢೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.
Tau441 ಮತ್ತು αS ನಡುವಿನ LLPS ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಟೌ ರೂಪಾಂತರವನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು, ಅವುಗಳೆಂದರೆ ಮೈಕ್ರೊಟ್ಯೂಬ್ಯೂಲ್-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಡೊಮೇನ್ (MTBD) ನಲ್ಲಿ ಜೋಡಿಯಾಗಿರುವ ಹೆಲಿಕಲ್ ಫಿಲಮೆಂಟ್ ಕೋರ್ (PHF) ತುಣುಕು, ಇದು ನಾಲ್ಕು ವಿಶಿಷ್ಟ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಡೊಮೇನ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರೆ, ಇದನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಕರೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ. K18 ತುಣುಕಾಗಿ (ಚಿತ್ರ 2e ನೋಡಿ).ಮೈಕ್ರೊಟ್ಯೂಬ್ಯೂಲ್-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಮುಂಚಿನ ಅನುಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಲೈನ್-ಸಮೃದ್ಧ ಡೊಮೇನ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಟೌ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗೆ αS ಆದ್ಯತೆಯಾಗಿ ಬಂಧಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ಇತ್ತೀಚೆಗೆ ವರದಿಯಾಗಿದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, PHF ಪ್ರದೇಶವು ಧನಾತ್ಮಕ ಆವೇಶದ ಉಳಿಕೆಗಳಲ್ಲಿ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿದೆ (ಚಿತ್ರ 2e ನೋಡಿ), ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಲೈಸಿನ್ (15% ಶೇಷಗಳು), ಈ ಪ್ರದೇಶವು αS/Tau ಸಂಕೀರ್ಣದ ಘನೀಕರಣಕ್ಕೆ ಸಹ ಕೊಡುಗೆ ನೀಡುತ್ತದೆಯೇ ಎಂದು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ನಮ್ಮನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಿತು.ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ (15% PEG ಅಥವಾ 20% ಡೆಕ್ಸ್ಟ್ರಾನ್‌ನೊಂದಿಗೆ LLPS ಬಫರ್) (ಚಿತ್ರ 2f) ಅಡಿಯಲ್ಲಿ K18 ಮಾತ್ರ 100 μM ವರೆಗಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ LLPS ಅನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ನಾವು 50 µM αS ಅನ್ನು 50 µM K18 ಗೆ ಸೇರಿಸಿದಾಗ, K18 ಮತ್ತು αS ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಹನಿಗಳ ಕ್ಷಿಪ್ರ ರಚನೆಯನ್ನು ನೆಫೆಲೋಮೆಟ್ರಿ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ Fig. 2d) ಮತ್ತು WF ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (Fig. 2f) ಮೂಲಕ ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ.ನಿರೀಕ್ಷೆಯಂತೆ, ΔCt-αS K18 (Fig. 2f) ನ LLPS ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ಪುನಃಸ್ಥಾಪಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗಲಿಲ್ಲ.αS/ΔNt-Tau ಅಥವಾ αS/Tau441 ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ LLPS ಅನ್ನು ಪ್ರೇರೇಪಿಸಲು αS/K18 ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಗೆ ಸ್ವಲ್ಪ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಅಗತ್ಯವಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸುತ್ತೇವೆ, ಇತರ ವಿಷಯಗಳು ಸಮಾನವಾಗಿರುತ್ತವೆ.ಇದು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಮೈಕ್ರೊಟ್ಯೂಬುಲ್-ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಡೊಮೇನ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಪ್ರೋಲೈನ್-ಸಮೃದ್ಧ ಟೌ ಡೊಮೇನ್‌ನೊಂದಿಗೆ αS C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರದೇಶದ ಬಲವಾದ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ 31 .
αS ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ΔNt-Tau LLPS ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲದ ಕಾರಣ, ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ Tau (ಐಸೊಟೈಪ್, Tau441/Tau441) ನೊಂದಿಗೆ LLPS ಸಿಸ್ಟಮ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಅದರ ಸರಳತೆಯನ್ನು ನೀಡಿದ αS/Tau LLPS ಅನ್ನು ನಿರೂಪಿಸಲು ನಾವು ಈ ಟೌ ರೂಪಾಂತರವನ್ನು ಮಾದರಿಯಾಗಿ ಆರಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಸಂಕೀರ್ಣ (ಹೆಟೆರೊಟೈಪಿಕ್, αS/Tau441) ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳೊಂದಿಗೆ.αS/Tau ಮತ್ತು αS/ΔNt-Tau ಸಿಸ್ಟಂಗಳಲ್ಲಿ αS ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯ ಮಟ್ಟವನ್ನು (ಕಂಡೆನ್ಸ್ಡ್ ಫೇಸ್ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಭಾಗವಾಗಿ, fαS,c) ನಾವು ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮತ್ತು ಚದುರಿದ ಹಂತದ SDS-PAGE ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಮೂಲಕ ಹೋಲಿಸಿದ್ದೇವೆ (2e ನೋಡಿ), ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಒಂದೇ ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ.ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ನಾವು ಕ್ರಮವಾಗಿ αS/Tau ಮತ್ತು αS/ΔNt-Tau ಗಾಗಿ fαS,c 84 ± 2% ಮತ್ತು 79 ± 7% ಅನ್ನು ಪಡೆದುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ, αS ಮತ್ತು tau ನಡುವಿನ ಹೆಟೆರೊಟೈಪಿಕ್ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯು ಟೌ ಅಣುಗಳ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಿಂತ ಉತ್ತಮವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ನಡುವೆ.
ವಿವಿಧ ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳೊಂದಿಗಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆ ಮತ್ತು αS ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರದ ಮೇಲೆ ಘನೀಕರಣ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಮೊದಲು ಫೋಟೊಬ್ಲೀಚಿಂಗ್ (FRAP) ವಿಧಾನದ ನಂತರ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಚೇತರಿಕೆಯಿಂದ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲಾಯಿತು.ನಾವು αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau ಮತ್ತು αS/pLK ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿದ್ದೇವೆ (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS ಮತ್ತು 100 μM Tau441 ಅಥವಾ ΔNt-TauK ಜೊತೆಗೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ).ಮಾದರಿ ಘಟಕಗಳನ್ನು ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿದ ನಂತರ ಮೊದಲ 30 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿ ಡೇಟಾವನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.ಪ್ರಾತಿನಿಧಿಕ FRAP ಚಿತ್ರಗಳಿಂದ (Fig. 3a, αS/Tau441 ಘನೀಕರಣ) ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಅನುಗುಣವಾದ ಸಮಯದ ಕೋರ್ಸ್ ಕರ್ವ್‌ಗಳಿಂದ (Fig. 3b, ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 3), αS ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರವು Tau441 ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೋಲುತ್ತದೆ ಎಂದು ಕಾಣಬಹುದು.ಮತ್ತು ΔNt-Tau, ಇದು pLK ಯೊಂದಿಗೆ ಹೆಚ್ಚು ವೇಗವಾಗಿರುತ್ತದೆ.FRAP (ಕಾಂಗ್ ಮತ್ತು ಇತರರು 35 ವಿವರಿಸಿದಂತೆ) ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ನ ಒಳಗಿನ αS ಗಾಗಿ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಲಾದ ಪ್ರಸರಣ ಗುಣಾಂಕಗಳು D = 0.013 ± 0.009 µm2/s ಮತ್ತು D = 0.026 ± 0.008 µm2/s ಗಾಗಿ αS/Tau-44 αS/ ವ್ಯವಸ್ಥೆ.pLK, Tau, ಮತ್ತು D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, ಕ್ರಮವಾಗಿ (Fig. 3c).ಆದಾಗ್ಯೂ, ಚದುರಿದ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಪ್ರಸರಣ ಗುಣಾಂಕ αS ಎಲ್ಲಾ ಮಂದಗೊಳಿಸಿದ ಹಂತಗಳಿಗಿಂತ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದ ಹಲವಾರು ಆದೇಶಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಕೋರಿಲೇಶನ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (FCS, ನೋಡಿ ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 3) ಅದೇ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ (LLPS ಬಫರ್) ಆದರೆ ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. (D = 8 ± 4 µm2/s).ಆದ್ದರಿಂದ, αS ಅನುವಾದದ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರವು ಚದುರಿದ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ, ಆದಾಗ್ಯೂ ಎಲ್ಲಾ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳು ಅವುಗಳ ರಚನೆಯ ನಂತರ ಮೊದಲ ಅರ್ಧ ಗಂಟೆಯಲ್ಲಿ ದ್ರವದಂತಹ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ, ಟೌ ಹಂತಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ.pLK ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ವೇಗವಾದ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರ.
ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ αS ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ (2% AF488-ಲೇಬಲ್ αS) ನ a-c FRAP ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ.ತ್ರಿವಳಿಗಳಲ್ಲಿ αS/Tau441 FRAP ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು (a) ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇಲ್ಲಿ ಕೆಂಪು ವಲಯಗಳು ಬಣ್ಣರಹಿತ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ 5 µm ಆಗಿದೆ.b ಸರಾಸರಿ FRAP ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳು ಮತ್ತು (c) 5-6 (N) ಗಾಗಿ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಿದ ಪ್ರಸರಣ ಗುಣಾಂಕಗಳು (D) 100 µM αS ಮತ್ತು Tau441 (ಕೆಂಪು) ಅಥವಾ ΔNt-Tau (ನೀಲಿ) ಅಥವಾ pLK (ಹಸಿರು) ನ ಈಕ್ವಿಮೋಲಾರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮೂರು ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಂದ ವಿಭಿನ್ನ ಹನಿಗಳು ಎಲ್‌ಎಲ್‌ಪಿಎಸ್‌ನ ಹತ್ತು ಪಟ್ಟು ಸಾಂದ್ರತೆ.FRAP ಕರ್ವ್ನ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನವನ್ನು ಮಬ್ಬಾದ ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಹೋಲಿಕೆಗಾಗಿ, ಚದುರಿದ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಪ್ರಸರಣ ಗುಣಾಂಕ αS ಅನ್ನು ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಕೋರಿಲೇಷನ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (ಎಫ್‌ಸಿಎಸ್) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಮೂರು ಬಾರಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಹೆಚ್ಚಿನ ಮಾಹಿತಿಗಾಗಿ ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 3 ಮತ್ತು ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ನೋಡಿ).d LLPS ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 100 μM TEMPOL-122-αS ನ ನಿರಂತರ X-ಬ್ಯಾಂಡ್ EPR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾ ಯಾವುದೇ ಪಾಲಿಕೇಶನ್ (ಕಪ್ಪು) ಇಲ್ಲದೆ ಅಥವಾ 100 μM Tau441 (ಕೆಂಪು) ಅಥವಾ ΔNt-Tau (ನೀಲಿ) ಅಥವಾ 1 mM pLK (ಹಸಿರು) ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ.ಅತ್ಯಂತ ನಾಟಕೀಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಸಂಭವಿಸುವ ಪ್ರಬಲ ಕ್ಷೇತ್ರ ರೇಖೆಗಳ ವರ್ಧಿತ ನೋಟವನ್ನು ಇನ್ಸೆಟ್ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.ಇ 50 μM TEMPOL-122-αS ನ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಕರ್ವ್‌ಗಳು LLPS ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ (PEG ಇಲ್ಲ) ವಿವಿಧ ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ.ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಿದ EPR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್‌ನ ಬ್ಯಾಂಡ್ II (IIII/III) ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಬ್ಯಾಂಡ್ III ನ ಕಡಿಮೆ ವೈಶಾಲ್ಯವು Tau441 (ಕೆಂಪು), ΔNt-Tau (ನೀಲಿ) ಮತ್ತು pLK (ಹಸಿರು) ಮೋಲಾರ್ ಅನುಪಾತಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪ್ರತಿ ಕರ್ವ್‌ನಲ್ಲಿ ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಮತ್ತು ಸ್ವತಂತ್ರ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಒರಟು ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಡೇಟಾಗೆ ಸರಿಹೊಂದುವಂತೆ ಬಣ್ಣದ ಗೆರೆಗಳು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾವನ್ನು ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾ ಫೈಲ್‌ಗಳ ರೂಪದಲ್ಲಿ ಒದಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಪೂರಕವಾಗಿ, ನಾವು ಡೈರೆಕ್ಟ್ ಸ್ಪಿನ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ (SDSL) ಮತ್ತು ನಿರಂತರ ಎಲೆಕ್ಟ್ರಾನ್ ಪ್ಯಾರಾಮ್ಯಾಗ್ನೆಟಿಕ್ ರೆಸೋನೆನ್ಸ್ (CW-EPR) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ವಿವಿಧ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ αS ನ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ತನಿಖೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ.ವಾಸ್ತವಿಕ ಉಳಿದಿರುವ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್36,37,38 ನೊಂದಿಗೆ IDP ಯ ನಮ್ಯತೆ ಮತ್ತು ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ವರದಿ ಮಾಡಲು ಈ ವಿಧಾನವು ತುಂಬಾ ಉಪಯುಕ್ತವಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸಾಬೀತಾಗಿದೆ.ಈ ನಿಟ್ಟಿನಲ್ಲಿ, ನಾವು ಸಿಂಗಲ್ ಸಿಸ್ ಮ್ಯಟೆಂಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಿಸ್ಟೀನ್ ಅವಶೇಷಗಳನ್ನು ನಿರ್ಮಿಸಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು 4-ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸಿ-2,2,6,6-ಟೆಟ್ರಾಮೆಥೈಲ್ಪಿಪೆರಿಡಿನ್-ಎನ್-ಆಕ್ಸಿಲ್ (TEMPOL) ಸ್ಪಿನ್ ಪ್ರೋಬ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ.ಮಾಲಿಮೈಡ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳು ಅವುಗಳನ್ನು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡುತ್ತವೆ.ಹೆಚ್ಚು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ, ನಾವು 122 ಅಥವಾ 24 αS (TEMPOL-122-αS ಮತ್ತು TEMPOL-24-αS) ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ TEMPOL ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಮೊದಲ ಪ್ರಕರಣದಲ್ಲಿ, ನಾವು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಸಿ-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಗುರಿಪಡಿಸುತ್ತೇವೆ, ಇದು ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿದೆ.ಬದಲಿಗೆ, ಸ್ಥಾನ 24 ನಮಗೆ ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಒಟ್ಟಾರೆ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಬಗ್ಗೆ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ನೀಡುತ್ತದೆ.ಎರಡೂ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಚದುರಿದ ಹಂತದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳಿಗೆ ಪಡೆದ EPR ಸಂಕೇತಗಳು ವೇಗವಾಗಿ ಚಲಿಸುವ ಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ನೈಟ್ರಾಕ್ಸೈಡ್ ರಾಡಿಕಲ್‌ಗಳಿಗೆ ಅನುಗುಣವಾಗಿರುತ್ತವೆ.ಟೌ ಅಥವಾ ಪಿಎಲ್‌ಕೆ (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ಅಥವಾ ΔNt-Tau 1:1 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ ಅಥವಾ pLK 1:10 ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ) ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಹಂತದ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆಯ ನಂತರ, ಸಾಪೇಕ್ಷ ಗರಿಷ್ಠ ತೀವ್ರತೆಯ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ αS ನ EPR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್.ನಷ್ಟದ ರೇಖೆಯು ವಿಸ್ತರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ, ದುರ್ಬಲಗೊಂಡ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಹನಿಗಳಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆಯಾದ αS ಮರುನಿರ್ದೇಶನ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (Fig. 3d, ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 4a).ಈ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಸ್ಥಾನ 122 ರಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿವೆ. 24 ನೇ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ pLK ಉಪಸ್ಥಿತಿಯು ತನಿಖೆಯ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರದ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರಲಿಲ್ಲ, 122 ನೇ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ರೋಹಿತದ ರೇಖೆಯ ಆಕಾರವು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಬದಲಾಗಿದೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 4a).ಸ್ಪಿನ್-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ IDP38,39 ನ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ವಿವರಿಸಲು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಬಳಸುವ ಐಸೊಟ್ರೊಪಿಕ್ ಮಾದರಿಯನ್ನು (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗರ್ 5a) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಎರಡು αS/ಪಾಲಿಕೇಶನ್ ಸಿಸ್ಟಮ್‌ಗಳ 122 ನೇ ಸ್ಥಾನದಲ್ಲಿ ನಾವು ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವನ್ನು ಮಾದರಿ ಮಾಡಲು ಪ್ರಯತ್ನಿಸಿದಾಗ, ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವನ್ನು ಪುನರ್ನಿರ್ಮಿಸಲು ನಮಗೆ ಸಾಧ್ಯವಾಗಲಿಲ್ಲ..24 ಸ್ಪಿನ್ಸ್ ಕಾಂಟ್ರಾಸ್ಟ್‌ಗಳ ಸ್ಥಾನದ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಲ್ ಸಿಮ್ಯುಲೇಶನ್ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ Fig. 5a).ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ αS ನ ಸಿ-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರದೇಶದ ಸ್ಪಿನ್ ಕಾನ್ಫಿಗರೇಶನ್‌ಗಳ ಜಾಗದಲ್ಲಿ ಆದ್ಯತೆಯ ಸ್ಥಾನಗಳಿವೆ ಎಂದು ಇದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ EPR ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಮಂದಗೊಳಿಸಿದ ಹಂತದಲ್ಲಿ αS ನ ಭಾಗವನ್ನು ಪರಿಗಣಿಸಿದಾಗ (84 ± 2%, 79 ± 7%, ಮತ್ತು 47 ± 4% αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, ಮತ್ತು αS/pLK, ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ-ನೋಡಿ ದತ್ತಾಂಶ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ Fig. 2e c), EPR ವಿಧಾನದಿಂದ ಪತ್ತೆಯಾದ ವಿಸ್ತರಣೆಯು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ αS ನ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರದೇಶದ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಮಂದಗೊಳಿಸಿದ ಹಂತದಲ್ಲಿ ವಿವಿಧ ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ (TEMPOL-122- ಬಳಸುವಾಗ ಮುಖ್ಯ ಬದಲಾವಣೆ. αS), ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಘನೀಕರಣವಲ್ಲ.ಮೈಕ್ರೋವಿಸ್ಕೋಸಿಟಿಯ ಹೆಚ್ಚಳವು ತನಿಖೆಯಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುತ್ತದೆ.ನಿರೀಕ್ಷೆಯಂತೆ, 1 M NaCl ಅನ್ನು ಮಿಶ್ರಣಕ್ಕೆ ಸೇರಿಸಿದಾಗ ಎಲ್‌ಎಲ್‌ಪಿಎಸ್ ಹೊರತುಪಡಿಸಿ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ EPR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ ಅನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಪುನಃಸ್ಥಾಪಿಸಲಾಯಿತು (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 4b).ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, CW-EPR ನಿಂದ ಪತ್ತೆಯಾದ ಬದಲಾವಣೆಗಳು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ αS ನ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರದೇಶದ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಮಂದಗೊಳಿಸಿದ ಹಂತದಲ್ಲಿ ವಿವಿಧ ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಮ್ಮ ಡೇಟಾ ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಈ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯು ಟೌಗಿಂತ pLK ಯೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಬಲವಾಗಿದೆ.
ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಕುರಿತು ಹೆಚ್ಚಿನ ರಚನಾತ್ಮಕ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಪಡೆಯಲು, ನಾವು NMR ಅನ್ನು ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ ಬಳಸಿಕೊಂಡು LLPS ವ್ಯವಸ್ಥೆಯನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು ನಿರ್ಧರಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ನಾವು ಚದುರಿದ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಉಳಿದಿರುವ αS ಭಾಗವನ್ನು ಮಾತ್ರ ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು, ಇದು ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ನೊಳಗಿನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವುದರಿಂದ ಮತ್ತು NMR ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ದ್ರಾವಣದ ಕೆಳಭಾಗದಲ್ಲಿರುವ ದಟ್ಟವಾದ ಹಂತದಿಂದಾಗಿರಬಹುದು.NMR (ಪೂರಕ Fig. 5c, d) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು LLPS ಮಾದರಿಯ ಚದುರಿದ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಉಳಿದಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ರಚನೆ ಮತ್ತು ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಅನ್ನು ನಾವು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದಾಗ, ಪ್ರೋಟೀನ್ pLK ಮತ್ತು ΔNt-Tau ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಬಹುತೇಕ ಒಂದೇ ರೀತಿಯಲ್ಲಿ ವರ್ತಿಸುವುದನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ. ಇದು ದ್ವಿತೀಯಕ ರಚನೆ ಮತ್ತು ಪ್ರೊಟೀನ್ ಬೆನ್ನೆಲುಬಿನ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿದ್ದು, ದ್ವಿತೀಯ ರಾಸಾಯನಿಕ ಪಲ್ಲಟ ಮತ್ತು R1ρ ವಿಶ್ರಾಂತಿಯ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಂದ ಬಹಿರಂಗಗೊಂಡಿದೆ.NMR ದತ್ತಾಂಶವು αS ನ C-ಟರ್ಮಿನಸ್ ತನ್ನ ಅಸ್ತವ್ಯಸ್ತತೆಯ ಸ್ವರೂಪವನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಂಡು, ಇತರ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಅನುಕ್ರಮದಂತೆ, ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳೊಂದಿಗಿನ ಅದರ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ನಮ್ಯತೆಯ ಗಮನಾರ್ಹ ನಷ್ಟವನ್ನು ಅನುಭವಿಸುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.
TEMPOL-122-αS ಮಂದಗೊಳಿಸಿದ ಹಂತದಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ CW-EPR ಸಿಗ್ನಲ್ ವಿಸ್ತರಣೆಯು ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆಯಾದ್ದರಿಂದ, LLPS ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ವಿವಿಧ ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳಿಗೆ αS ನ ಬಂಧಿಸುವ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು ನಾವು EPR ಟೈಟರೇಶನ್ ಅನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸಿದ್ದೇವೆ (ಯಾವುದೇ ಶೇಖರಣೆ ಇಲ್ಲ. ಬಫರ್ LLPS), ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿದ ಮತ್ತು ಕೇಂದ್ರೀಕೃತ ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳು ಒಂದೇ ಆಗಿರುತ್ತವೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (ಇದು ನಮ್ಮ ಡೇಟಾ, ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 4a ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 6 ರಿಂದ ದೃಢೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ).ಎಲ್ಲಾ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳು ಅವುಗಳ ಸಾಮಾನ್ಯ ದ್ರವದಂತಹ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳ ಹೊರತಾಗಿಯೂ, ಆಣ್ವಿಕ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಆಧಾರವಾಗಿರುವ ಭೇದಾತ್ಮಕ ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತವೆಯೇ ಎಂದು ನೋಡುವುದು ಗುರಿಯಾಗಿತ್ತು.ನಿರೀಕ್ಷೆಯಂತೆ, EPR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್ ಹೆಚ್ಚುತ್ತಿರುವ ಪಾಲಿಕೇಶನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ವಿಸ್ತರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ, ಎಲ್ಲಾ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಯ ಪಾಲುದಾರರ ಆಣ್ವಿಕ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳಿಂದಾಗಿ ಆಣ್ವಿಕ ನಮ್ಯತೆಯಲ್ಲಿನ ಇಳಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ (ಚಿತ್ರ 3e, ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 6).ΔNt-Tau ಮತ್ತು Tau441 ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ pLK ಕಡಿಮೆ ಮೋಲಾರ್ ಅನುಪಾತದಲ್ಲಿ (ಪಾಲಿಕೇಶನ್:αS) ಈ ಶುದ್ಧತ್ವವನ್ನು ಸಾಧಿಸಿದೆ.ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, n ಒಂದೇ ಮತ್ತು ಸ್ವತಂತ್ರ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಊಹಿಸುವ ಅಂದಾಜು ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಮಾದರಿಯೊಂದಿಗೆ ಡೇಟಾದ ಹೋಲಿಕೆಯು pLK (~ 5 μM) ನ ಸ್ಪಷ್ಟವಾದ ವಿಘಟನೆ ಸ್ಥಿರಾಂಕವು Tau441 ಅಥವಾ ΔNt-Tau (~50 μM) ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆ ಪ್ರಮಾಣದ ಕ್ರಮವಾಗಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ. )µM).ಇದು ಸ್ಥೂಲ ಅಂದಾಜು ಆಗಿದ್ದರೂ, ನಿರಂತರ ಧನಾತ್ಮಕ ಚಾರ್ಜ್ ಪ್ರದೇಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಸರಳವಾದ ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳಿಗೆ αS ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ಇದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.αS ಮತ್ತು ವಿವಿಧ ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಸಂಬಂಧದಲ್ಲಿನ ಈ ವ್ಯತ್ಯಾಸವನ್ನು ಗಮನಿಸಿದರೆ, ಅವುಗಳ ದ್ರವ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳು ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ ವಿಭಿನ್ನವಾಗಿ ಬದಲಾಗಬಹುದು ಮತ್ತು ಹೀಗಾಗಿ ವಿಭಿನ್ನ LSPT ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳಿಂದ ಬಳಲುತ್ತಿದ್ದಾರೆ ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸಿದ್ದೇವೆ.
ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕೋಸರ್ವೇಟ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಸ್ವಭಾವದೊಳಗೆ ಹೆಚ್ಚು ಕಿಕ್ಕಿರಿದ ವಾತಾವರಣವನ್ನು ನೀಡಲಾಗಿದೆ, ಸಂಭವನೀಯ LSPT ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಲು ನಾವು ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ನ ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ.BF ಮತ್ತು CF ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು (ಚಿತ್ರ 4), ನಾವು αS/Tau441 ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ ದೊಡ್ಡ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಹೆಪ್ಪುಗಟ್ಟುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ನಿರೀಕ್ಷಿಸಿದಂತೆ ಬಾವಿ/ಸ್ಲೈಡ್‌ನ ಕೆಳಭಾಗದಲ್ಲಿರುವ ಮೇಲ್ಮೈಯನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣ ಹನಿಗಳಾಗಿ ಸಂಪರ್ಕಿಸುವ ಮತ್ತು ತೇವಗೊಳಿಸುವ ದೊಡ್ಡ ಹನಿಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 7d);ನಾವು ಈ ಕೆಳಗಿನ ರಚನೆಗಳನ್ನು "ಪ್ರೋಟೀನ್ ರಾಫ್ಟ್ಸ್" ಎಂದು ಕರೆಯುತ್ತೇವೆ.ಈ ರಚನೆಗಳು ಸಮ್ಮಿಳನ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಂಡಿರುವುದರಿಂದ ದ್ರವವಾಗಿಯೇ ಉಳಿದಿವೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 7b) ಮತ್ತು LLPS ಅನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸಿದ ನಂತರ ಹಲವಾರು ಗಂಟೆಗಳವರೆಗೆ ನೋಡಬಹುದಾಗಿದೆ (Fig. 4 ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 7c).ಅಸಮತೋಲಿತ ಚಾರ್ಜ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಮೇಲ್ಮೈ ವಿಭವಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ನಿರೀಕ್ಷಿಸಿದಂತೆ, ತೇವ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ವಸ್ತುಗಳಿಗಿಂತ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗ್. 7a) ಹೈಡ್ರೋಫಿಲಿಕ್ ಮೇಲ್ಮೈಯಲ್ಲಿ ಒಲವು ಹೊಂದಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ, αS/ΔNt-Tau ಕೋಲೆಸೆನ್ಸ್ ಮತ್ತು ರಾಫ್ಟಿಂಗ್ ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ, ಆದರೆ αS/pLK ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ಗಳು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ (Fig. 4).ಸಣ್ಣ ಕಾವು ಸಮಯದಲ್ಲಿ, αS/pLK ಹನಿಗಳು ಹೈಡ್ರೋಫಿಲಿಕ್ ಮೇಲ್ಮೈಯನ್ನು ಒಗ್ಗೂಡಿಸಲು ಮತ್ತು ತೇವಗೊಳಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಯಿತು, ಆದರೆ ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ನಿಂತುಹೋಯಿತು ಮತ್ತು 5 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾವು ನಂತರ, ಸೀಮಿತವಾದ ಸಂಯೋಜನೆಯ ಘಟನೆಗಳು ಮತ್ತು ಯಾವುದೇ ತೇವವನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ.- ಜೆಲ್-ಡ್ರಿಪ್ ಪರಿವರ್ತನೆ.
100 µM αS (1% ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಲೇಬಲ್) ಹೊಂದಿರುವ ಕೋಸರ್ವೇಟ್ ಮಾದರಿಗಳ ಪ್ರತಿನಿಧಿ BF (ಗ್ರೇಸ್ಕೇಲ್ ಪ್ಯಾನೆಲ್‌ಗಳು) ಮತ್ತು CF (ಬಲ ಫಲಕಗಳು, AF488-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ αS ಹಸಿರು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ) LLPS ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ 100 µM ಟೌಫ್ಲೋರೆಸೆಂಟ್ ಚಿತ್ರಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ 100 µM αS (1% ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಲೇಬಲ್) -ಟೌ (ಮಧ್ಯ) ಅಥವಾ 1 mM pLK (ಕೆಳಗೆ) ವಿವಿಧ ಕಾವು ಸಮಯ ಮತ್ತು ಫೋಕಲ್ ಎತ್ತರಗಳಲ್ಲಿ (z, ಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಕೆಳಭಾಗದಿಂದ ದೂರ).ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಒಂದೇ ಫಲಿತಾಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಪರಸ್ಪರ ಸ್ವತಂತ್ರವಾಗಿ 4-6 ಬಾರಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಗಿದೆ.αS/Tau441 ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳನ್ನು 24 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ ತೇವಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಚಿತ್ರಕ್ಕಿಂತ ದೊಡ್ಡ ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುತ್ತದೆ.ಎಲ್ಲಾ ಚಿತ್ರಗಳ ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ 20 µm ಆಗಿದೆ.
αS/Tau441 LLPS ನಲ್ಲಿ ರೂಪುಗೊಂಡ ದೊಡ್ಡ ದ್ರವದಂತಹ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪೂಲ್‌ಗಳು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಿದ ಯಾವುದೇ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತವೆಯೇ ಎಂದು ನಾವು ನಂತರ ಕೇಳಿದ್ದೇವೆ.ನಾವು αS/Tau441 ಹನಿಗಳ ಪಕ್ವತೆಯನ್ನು ಕಾಲಕ್ರಮೇಣ WF ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಯೊಂದಿಗೆ ಅನುಸರಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಆದರೆ 1 μM AF488-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ αS ಮತ್ತು Atto647N-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ Tau441 (Fig. 5a) ಅನ್ನು ಬಳಸುತ್ತೇವೆ.ನಿರೀಕ್ಷೆಯಂತೆ, ನಾವು ಪಕ್ವತೆಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಉದ್ದಕ್ಕೂ ಸಂಪೂರ್ಣ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸ್ಥಳೀಕರಣವನ್ನು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ca ನಿಂದ.5 ಗಂಟೆಗಳ ನಂತರ, ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳ ಒಳಗೆ ಹೆಚ್ಚು ತೀವ್ರವಾದ ವೃತ್ತಾಕಾರದ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು, ಅದನ್ನು ನಾವು "ಪಾಯಿಂಟ್‌ಗಳು" ಎಂದು ಕರೆಯುತ್ತೇವೆ, ಅವುಗಳಲ್ಲಿ ಕೆಲವು αS ನೊಂದಿಗೆ ಕೊಲೊಕಲೈಸ್ ಆಗಿವೆ ಮತ್ತು ಕೆಲವು Tau441 (Fig. 5a, ಬಿಳಿ ಬಾಣಗಳು) ನಲ್ಲಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟವು.αS/ΔNt-Tau ಗಿಂತ αS/ΔNt-Tau ಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಈ ತಾಣಗಳನ್ನು ಯಾವಾಗಲೂ ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ.ಸಮ್ಮಿಳನ/ತೇವಗೊಳಿಸುವಿಕೆಗೆ ಅಸಮರ್ಥವಾದ pLK ಮತ್ತು ಟೌ ಸಿಸ್ಟಮ್‌ಗಳ ಹನಿಗಳಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಪ್ರತ್ಯೇಕ ತಾಣಗಳಿಲ್ಲ.αS ಮತ್ತು Tau441 ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಈ ಕಲೆಗಳು ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ತರಹದ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳಾಗಿವೆಯೇ ಎಂದು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು, ನಾವು CF ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಇದೇ ರೀತಿಯ ಪ್ರಯೋಗವನ್ನು ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ, ಇದರಲ್ಲಿ Tau441 ಅನ್ನು Atto647N ನೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 12.5 μM ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಥಿಯೋಫ್ಲಾವಿನ್-T (ThT) ಅನ್ನು ಪ್ರಾರಂಭದಿಂದ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.ಬಣ್ಣ.αS/Tau441 ಹನಿಗಳು ಅಥವಾ ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳ ThT-ಸ್ಟೇನಿಂಗ್ ಅನ್ನು 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾವು ನಂತರವೂ ಗಮನಿಸಲಾಗಿಲ್ಲ (Fig. 5b, ಮೇಲಿನ ಸಾಲು-ಪ್ರೋಟೀನ್ ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ಉಳಿದಿರುವ ಹನಿಗಳು), ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳ ಒಳಗೆ Atto647N-Tau441 ಹೊಂದಿರುವ ThT-ಧನಾತ್ಮಕ ರಚನೆಗಳು ತುಂಬಾ ದುರ್ಬಲವಾಗಿವೆ.ಇದು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದ ಕಲೆಗಳ ಗಾತ್ರ, ಆಕಾರ ಮತ್ತು ಸ್ಥಳವನ್ನು ಪುನರಾವರ್ತಿಸುತ್ತದೆ (Fig. 5b, ಮಧ್ಯ ಮತ್ತು ಕೆಳಗಿನ ಸಾಲುಗಳು), ವಯಸ್ಸಾದ ದ್ರವ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ರೂಪುಗೊಂಡ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್-ತರಹದ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳಿಗೆ ಕಲೆಗಳು ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗಬಹುದು ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ವಿವಿಧ ಕಾವು ಸಮಯಗಳಲ್ಲಿ WF 25 μM αS ಮತ್ತು 25 μM ಟೌ441 (1 μM AF488-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ αS ಮತ್ತು Atto647N-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ Tau441) ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಫೋಕಲ್ ಎತ್ತರಗಳು (z, ಅನ್‌ಬೌಂಡ್ ಕೆಳಗಿನಿಂದ ದೂರ) LLPS ಬಫರ್ ಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಬಾವಿಯಲ್ಲಿ .ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಆರು ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಸ್ವತಂತ್ರವಾಗಿ ಪುನರಾವರ್ತಿಸಲಾಯಿತು.25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ Tau441) ಮತ್ತು 12.5 μM ಥಿಯೋಫ್ಲಾವಿನ್-T (ThT) ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ 25 μM αS ನ b CF ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕ ಚಿತ್ರ.ತೂಕದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಹನಿಗಳು ಮತ್ತು ಠೇವಣಿ ಮಾಡಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಚುಕ್ಕೆಗಳನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ ಮೇಲಿನ ಮತ್ತು ಮಧ್ಯದ ಸಾಲುಗಳಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಕೆಳಗಿನ ಸಾಲು ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಮತ್ತು 3 ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳಿಂದ ಹನಿಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.ಬಿಳಿ ಬಾಣಗಳು ಎರಡೂ ಫಲಕಗಳಲ್ಲಿ ThT-ಧನಾತ್ಮಕ ಚುಕ್ಕೆಗಳನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತವೆ.ಎಲ್ಲಾ ಚಿತ್ರಗಳ ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ 20 µm ಆಗಿದೆ.
ದ್ರವದಿಂದ ಘನಕ್ಕೆ ಪರಿವರ್ತನೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕೋಸರ್ವೇಟ್ ಪ್ರೋಟೀನ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ನಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ವಿವರವಾಗಿ ಪರಿಶೀಲಿಸಲು, ನಾವು ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಲೈಫ್‌ಟೈಮ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ (FLIM) ಮತ್ತು Förster ರೆಸೋನೆನ್ಸ್ ಎನರ್ಜಿ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಫರ್ ಮೈಕ್ರೊಸ್ಕೋಪಿ (FRET) ಅನ್ನು ಬಳಸಿದ್ದೇವೆ (ಚಿತ್ರ 6 ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರಗಳು 8 ಮತ್ತು 9).ಪದರದ ಕೋಸರ್ವೇಟ್ ಪಕ್ವತೆಯು ಹೆಚ್ಚು ಮಂದಗೊಳಿಸಿದ ಅಥವಾ ಘನ-ರೀತಿಯ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ರಚನೆಗೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮತ್ತು ಅದರೊಂದಿಗೆ ಲಗತ್ತಿಸಲಾದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತನಿಖೆಯ ನಡುವಿನ ನಿಕಟ ಸಂಪರ್ಕಕ್ಕೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಊಹಿಸಿದ್ದೇವೆ. , ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ 40.,41,42.ಹೆಚ್ಚುವರಿಯಾಗಿ, ಡಬಲ್ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ (AF488 ಮತ್ತು Atto647N ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ FRET ದಾನಿ ಮತ್ತು ಸ್ವೀಕರಿಸುವ ಬಣ್ಣಗಳು), τ ನಲ್ಲಿನ ಈ ಇಳಿಕೆಯು ಕೋಸರ್ವೇಟ್ ಸಾಂದ್ರೀಕರಣ ಮತ್ತು LSPT ಸಮಯದಲ್ಲಿ FRET(E) ದಕ್ಷತೆಯ ಹೆಚ್ಚಳದೊಂದಿಗೆ ಸಹ ಇರುತ್ತದೆ.ನಾವು LLPS αS/Tau441 ಮತ್ತು αS/ΔNt-Tau ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ರಾಫ್ಟ್ ಮತ್ತು ಸ್ಪಾಟ್ ರಚನೆಯನ್ನು ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ (1 µM AF488 ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ LLPS ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಪ್ರತಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ 25 µM αS ಮತ್ತು/ಅಥವಾ Atto647N ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ Tau441 ಅಥವಾ Tau).AF488 (τ488) ಮತ್ತು Atto647N (τ647N) ಪ್ರೋಬ್‌ಗಳ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಜೀವಿತಾವಧಿಯು ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳು ಪಕ್ವವಾದಂತೆ ಸ್ವಲ್ಪ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ (Fig. 6 ಮತ್ತು ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 8c) ನಲ್ಲಿ ನಾವು ಸಾಮಾನ್ಯ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳೊಳಗಿನ ಚುಕ್ಕೆಗಳಿಗೆ (Fig. 6c) ಈ ಬದಲಾವಣೆಯನ್ನು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ವರ್ಧಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು ಚುಕ್ಕೆಗಳಲ್ಲಿ ಮತ್ತಷ್ಟು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಘನೀಕರಣವು ಸಂಭವಿಸಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಇದಕ್ಕೆ ಬೆಂಬಲವಾಗಿ, 24 ಗಂ ವಯಸ್ಸಿನ αS/ΔNt-Tau ಹನಿಗಳಿಗೆ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಜೀವಿತಾವಧಿಯಲ್ಲಿ ಯಾವುದೇ ಗಮನಾರ್ಹ ಬದಲಾವಣೆ ಕಂಡುಬಂದಿಲ್ಲ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ. 8d), ಹನಿಗಳ ಜಿಲೇಶನ್ ಎನ್ನುವುದು ಗುರುತಿಸುವಿಕೆಯಿಂದ ಭಿನ್ನವಾದ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಇದು ಗಮನಾರ್ಹವಾದ ಅಣುಗಳ ಮರುಸಂಘಟನೆಯೊಂದಿಗೆ ಇರುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಕೋಸರ್ವೇಟ್ಸ್ ಒಳಗೆ.ಚುಕ್ಕೆಗಳು αS ನಲ್ಲಿ ವಿಭಿನ್ನ ಗಾತ್ರಗಳು ಮತ್ತು ವೇರಿಯಬಲ್ ವಿಷಯವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ಗಮನಿಸಬೇಕು, ವಿಶೇಷವಾಗಿ αS/Tau441 ವ್ಯವಸ್ಥೆಗೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 8e).ಸ್ಪಾಟ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಜೀವಿತಾವಧಿಯಲ್ಲಿನ ಇಳಿಕೆಯು ತೀವ್ರತೆಯ ಹೆಚ್ಚಳದೊಂದಿಗೆ ಸೇರಿಕೊಂಡಿದೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ Atto647N ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ Tau441 (ಪೂರಕ Fig. 8a), ಮತ್ತು αS/Tau441 ಮತ್ತು αS/ΔNt-Tau ಎರಡೂ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ FRET ದಕ್ಷತೆಗಳು, ಮತ್ತಷ್ಟು ಐದು ಗಂಟೆಗಳ ಸಾಂದ್ರೀಕರಣವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ. ಪ್ರಚೋದಿಸಿದ ನಂತರ, ಸ್ಥಿರ ವಿದ್ಯುಚ್ಛಕ್ತಿಯೊಳಗಿನ ಪ್ರೋಟೀನ್ಗಳು ಮಂದಗೊಳಿಸಲ್ಪಟ್ಟವು.αS/ΔNt-Tau ಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ, ನಾವು αS/Tau441 ತಾಣಗಳಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ τ647N ಮತ್ತು ಸ್ವಲ್ಪ ಹೆಚ್ಚಿನ τ488 ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಜೊತೆಗೆ ಕಡಿಮೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚು ಅಸಮಂಜಸವಾದ FRET ಮೌಲ್ಯಗಳು.ಪ್ರಾಯಶಃ, ಇದು αS/Tau441 ವ್ಯವಸ್ಥೆಯಲ್ಲಿ, ಗಮನಿಸಲಾದ ಮತ್ತು ನಿರೀಕ್ಷಿತ αS ಸಮುಚ್ಚಯವು ಹೆಚ್ಚು ವೈವಿಧ್ಯಮಯವಾಗಿದೆ, ಟೌಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಸಬ್‌ಸ್ಟೊಯಿಯೋಮೆಟ್ರಿಕ್ ಆಗಿದೆ, ಏಕೆಂದರೆ Tau441 ಸ್ವತಃ LLPS ಮತ್ತು ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಗೆ ಒಳಗಾಗಬಹುದು (ಪೂರಕ) ಚಿತ್ರ. .ಆದಾಗ್ಯೂ, Tau441 ಮತ್ತು αS ಇವೆರಡೂ ಇರುವಾಗ ದ್ರವದ ತರಹದ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳೊಳಗಿನ ಸಣ್ಣಹನಿಗಳ ಸಂಯೋಜನೆ, ರಾಫ್ಟ್ ರಚನೆ ಮತ್ತು ಮುಖ್ಯವಾಗಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯ ಮಟ್ಟವು ಗರಿಷ್ಠವಾಗಿರುತ್ತದೆ.
ಪ್ರತಿ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ 25 μM ನಲ್ಲಿ αS/Tau441 ಮತ್ತು αS/ΔNt-Tau ನ ಜೀವಮಾನದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕ (FLIM) ಚಿತ್ರಗಳು (1 μM AF488-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ αS ಮತ್ತು 1 μM Atto647N-ಲೇಬಲ್ Tau441-TauPS ನಲ್ಲಿ Tau441-TauPS ನಲ್ಲಿ.ಕಾಲಮ್‌ಗಳು ವಿವಿಧ ಪಕ್ವತೆಯ ಸಮಯಗಳಲ್ಲಿ (30 ನಿಮಿಷ, 5 ಗಂ ಮತ್ತು 24 ಗಂ) LLPS ಮಾದರಿಗಳ ಪ್ರಾತಿನಿಧಿಕ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.ಕೆಂಪು ಚೌಕಟ್ಟು αS/Tau441 ತಾಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.ಜೀವಿತಾವಧಿಯನ್ನು ಬಣ್ಣದ ಪಟ್ಟಿಗಳಾಗಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಎಲ್ಲಾ ಚಿತ್ರಗಳಿಗೆ ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ = 20 µm.b ಪ್ಯಾನೆಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಕೆಂಪು ಬಾಕ್ಸ್‌ನಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಿರುವ ಆಯ್ದ ಪ್ರದೇಶದ FLIM ಇಮೇಜ್ ಅನ್ನು ಜೂಮ್-ಇನ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಪ್ಯಾನೆಲ್ a ನಲ್ಲಿರುವಂತೆಯೇ ಅದೇ ಬಣ್ಣದ ಮಾಪಕವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಜೀವನ ಶ್ರೇಣಿಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಸ್ಕೇಲ್ ಬಾರ್ = 5 µm.c ಹಿಸ್ಟೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳು AF488 (αS ಗೆ ಲಗತ್ತಿಸಲಾಗಿದೆ) ಅಥವಾ Atto647N (Tau ಗೆ ಲಗತ್ತಿಸಲಾಗಿದೆ) ವಿವಿಧ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಜಾತಿಗಳಿಗೆ (ಹನಿಗಳು-D-, ರಾಫ್ಟ್-R- ಮತ್ತು ಸ್ಪೆಕಲ್-P) αS- ಗಾಗಿ ದಾಖಲಿಸಲಾದ FLIM ಚಿತ್ರಗಳಲ್ಲಿ ಗುರುತಿಸಲಾಗಿದೆ) ಟೈಮಿಂಗ್ ವಿತರಣೆಗಳು Tau441 ನ ಜೀವಿತಾವಧಿ αS/ΔNt-Tau coacervate ಮಾದರಿಗಳು (D ಗಾಗಿ N = 17-32 ROI, R ಗಾಗಿ 29-44 ROI, ಮತ್ತು ಅಂಕಗಳಿಗಾಗಿ 21-51 ROI).ಸರಾಸರಿ ಮತ್ತು ಸರಾಸರಿ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ ಪೆಟ್ಟಿಗೆಗಳ ಒಳಗೆ ಹಳದಿ ಚೌಕಗಳು ಮತ್ತು ಕಪ್ಪು ರೇಖೆಗಳಾಗಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪೆಟ್ಟಿಗೆಯ ಕೆಳಗಿನ ಮತ್ತು ಮೇಲಿನ ಗಡಿಗಳು ಕ್ರಮವಾಗಿ ಮೊದಲ ಮತ್ತು ಮೂರನೇ ಕ್ವಾರ್ಟೈಲ್‌ಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿನಿಧಿಸುತ್ತವೆ ಮತ್ತು 1.5 ಪಟ್ಟು ಇಂಟರ್‌ಕ್ವಾರ್ಟೈಲ್ ಶ್ರೇಣಿಯ (IQR) ಒಳಗೆ ಕನಿಷ್ಠ ಮತ್ತು ಗರಿಷ್ಠ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ವಿಸ್ಕರ್‌ಗಳಾಗಿ ತೋರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಔಟ್ಲೈಯರ್ಗಳನ್ನು ಕಪ್ಪು ವಜ್ರಗಳಾಗಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಜೋಡಿ ವಿತರಣೆಗಳ ನಡುವಿನ ಅಂಕಿಅಂಶಗಳ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಎರಡು-ಮಾದರಿ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಅಸಮಾನ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಊಹಿಸಲಾಗಿದೆ.ಎರಡು-ಬಾಲದ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಯ p-ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಪ್ರತಿ ಜೋಡಿ ಹೋಲಿಸಿದ ಡೇಟಾಗೆ ನಕ್ಷತ್ರ ಚಿಹ್ನೆಗಳೊಂದಿಗೆ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ (* p-ಮೌಲ್ಯ > 0.01, ** p-ಮೌಲ್ಯ > 0.001, *** p-ಮೌಲ್ಯ > 0.0001, **** p-ಮೌಲ್ಯ > 0.00001), ns ನಿರ್ಲಕ್ಷ್ಯವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ (p-ಮೌಲ್ಯ > 0.05).ನಿಖರವಾದ p ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಪೂರಕ ಕೋಷ್ಟಕ 1 ರಲ್ಲಿ ನೀಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಮೂಲ ಡೇಟಾವನ್ನು ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾ ಫೈಲ್‌ಗಳಾಗಿ ಪ್ರಸ್ತುತಪಡಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಸ್ಪೆಕಲ್ಸ್/ಒಟ್ಟುಗಳ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ತರಹದ ಸ್ವಭಾವವನ್ನು ಮತ್ತಷ್ಟು ಪ್ರದರ್ಶಿಸಲು, ನಾವು (1 M) NaCl ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ ಕಲೆಯಿಲ್ಲದ ಕೋಸರ್ವೇಟ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಸಂಸ್ಕರಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಿಂದ ಒಟ್ಟುಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಕಾರಣವಾಯಿತು.ಪರಮಾಣು ಬಲದ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕವನ್ನು (AFM) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳನ್ನು (ಅಂದರೆ, ಸಮುಚ್ಚಯಗಳ ಚದುರಿದ ಪರಿಹಾರ) ಗಮನಿಸಿದಾಗ, ನಾವು ಸುಮಾರು 15 nm ನಷ್ಟು ನಿಯಮಿತ ಎತ್ತರದೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಧಾನವಾಗಿ ಗೋಲಾಕಾರದ ರೂಪವಿಜ್ಞಾನವನ್ನು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಇದು ಹೆಚ್ಚಿನ ಉಪ್ಪಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಸಂಯೋಜಿಸುತ್ತದೆ. ಮೇಲ್ಮೈಯಲ್ಲಿ ಬಲವಾದ ಹೈಡ್ರೋಫೋಬಿಕ್ ಪರಿಣಾಮದಿಂದಾಗಿ ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳ ನಡವಳಿಕೆ (ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ~10 nm ಎತ್ತರವನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ) (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 10a).ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಸ್ಟ್ಯಾಂಡರ್ಡ್ ThT ಪ್ರತಿದೀಪಕ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಲ್ಲಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳನ್ನು ThT ಯೊಂದಿಗೆ ಕಾವು ಮಾಡಿದಾಗ, ನಾವು ThT ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಕ್ವಾಂಟಮ್ ಇಳುವರಿಯಲ್ಲಿ ನಾಟಕೀಯ ಹೆಚ್ಚಳವನ್ನು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಬಣ್ಣವು ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ αS ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಬ್ರಿಲ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ) ಕಾವು ಮಾಡಿದಾಗ ಗಮನಿಸಿದ ಹೋಲಿಕೆಗೆ ಹೋಲಿಸಬಹುದು. ಕೋಸರ್ವೇಟ್ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳು ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ತರಹದ ರಚನೆಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ..ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ಸಮುಚ್ಚಯಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ಉಪ್ಪಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಿಗೆ ಸಹಿಷ್ಣುವಾಗಿರುತ್ತವೆ ಆದರೆ ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳಂತೆ 4 M ಗ್ವಾನಿಡಿನ್ ಕ್ಲೋರೈಡ್ (GdnHCl) ಗೆ ಸಂವೇದನಾಶೀಲವಾಗಿರುತ್ತವೆ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 10c).
ಮುಂದೆ, ಸಿಂಗಲ್ ಮಾಲಿಕ್ಯೂಲ್ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್, ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸಂಬಂಧ/ಅಡ್ಡ-ಸಂಬಂಧ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ (ಎಫ್‌ಸಿಎಸ್/ಎಫ್‌ಸಿಸಿಎಸ್) ಮತ್ತು ಎರಡು-ಬಣ್ಣದ ಕಾಕತಾಳೀಯ ಪತ್ತೆ (ಟಿಸಿಸಿಡಿ) ಯ ಬರ್ಸ್ಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಾವು ಒಟ್ಟುಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಈ ನಿಟ್ಟಿನಲ್ಲಿ, ನಾವು 100 μl LLPS ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ αS ಮತ್ತು Tau441 (ಎರಡೂ 25 μM) ಜೊತೆಗೆ 1 μM AF488-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ αS ಮತ್ತು 1 μM Atto647N-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಿದ Tau441 ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ 100 μl LLPS ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ 24 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾವು ನಂತರ ರೂಪುಗೊಂಡ ಒಟ್ಟುಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಎಲ್‌ಎಲ್‌ಪಿಎಸ್ ಮತ್ತು ಪ್ರೊಟೀನ್‌ಗಳ ನಡುವಿನ ಯಾವುದೇ ಸಂಭವನೀಯ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಸಂವಹನಗಳನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು ಅದೇ PEG-ಮುಕ್ತ ಬಫರ್ ಮತ್ತು 1 M NaCl (ಒಟ್ಟುಗಳನ್ನು ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ನಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲು ಬಳಸುವ ಅದೇ ಬಫರ್) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಚದುರಿದ ಒಟ್ಟು ಪರಿಹಾರವನ್ನು ಮೊನೊಮಾಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಸ್ಥಿತಿಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿ.ಒಂದೇ ಅಣುವಿನ ಸಮಯದ ಪಥದ ಉದಾಹರಣೆಯನ್ನು ಚಿತ್ರ 7a ನಲ್ಲಿ ಕಾಣಬಹುದು.FCCS/FCS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ (ಅಡ್ಡ-ಸಂಬಂಧ, CC ಮತ್ತು ಸ್ವಯಂ-ಸಂಬಂಧ, AC) ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ αS ಮತ್ತು ಟೌ ಹೊಂದಿರುವ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳು ಹೇರಳವಾಗಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಚಿತ್ರ 7b, ಎಡ ಫಲಕದಲ್ಲಿ CC ಕರ್ವ್ ನೋಡಿ), ಮತ್ತು ಉಳಿದಿರುವ ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ ಪ್ರೊಟೀನ್‌ನ ಅಧಿಕವು ಹುಟ್ಟಿಕೊಂಡಿತು. ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಫಲಿತಾಂಶ (ಚಿತ್ರ 7b, ಎಡ ಫಲಕದಲ್ಲಿ AC ಕರ್ವ್‌ಗಳನ್ನು ನೋಡಿ).ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅದೇ ಪರಿಹಾರದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ನಡೆಸಿದ ನಿಯಂತ್ರಣ ಪ್ರಯೋಗಗಳು ಯಾವುದೇ CC ಕರ್ವ್‌ಗಳನ್ನು ತೋರಿಸಲಿಲ್ಲ, ಮತ್ತು AC ಕರ್ವ್‌ಗಳು ಒಂದು-ಘಟಕ ಪ್ರಸರಣ ಮಾದರಿಯೊಂದಿಗೆ ಚೆನ್ನಾಗಿ ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ (Eq. 4), ಅಲ್ಲಿ ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ನಿರೀಕ್ಷಿತ ಪ್ರಸರಣ ಗುಣಾಂಕಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ (Fig. 7b. ), ಬಲ ಫಲಕ).ಒಟ್ಟುಗೂಡಿದ ಕಣಗಳ ಪ್ರಸರಣ ಗುಣಾಂಕವು 1 µm2/s ಗಿಂತ ಕಡಿಮೆಯಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಸುಮಾರು 1 µm2/s ಆಗಿದೆ.50-100 µm/s;ಮೌಲ್ಯಗಳು ಸೋನಿಕೇಟೆಡ್ αS ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ αS ಗಾಗಿ ಈ ಹಿಂದೆ ಪ್ರಕಟಿಸಿದ ಮೌಲ್ಯಗಳಿಗೆ ಹೋಲುತ್ತವೆ.TCCD ಸ್ಫೋಟ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯೊಂದಿಗೆ ನಾವು ಒಟ್ಟುಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದಾಗ (Fig. 7c, ಮೇಲಿನ ಫಲಕ), ಪ್ರತಿ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿತ ಒಟ್ಟು (αS/Tau ಹೆಟೆರೊಗ್ರೇಗೇಟ್) ನಲ್ಲಿ ಸುಮಾರು 60% ಪತ್ತೆಯಾದ ಒಟ್ಟುಗಳು αS ಮತ್ತು tau ಎರಡನ್ನೂ ಒಳಗೊಂಡಿವೆ, ಸುಮಾರು 30% ಮಾತ್ರ ಒಳಗೊಂಡಿವೆ ಟೌ, ಸುಮಾರು 10% αS ಮಾತ್ರ.αS/Tau heteroaggregates ನ Stoichiometric ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಹೆಚ್ಚಿನ ಹೆಟೆರೊಗ್ರೆಗೇಟ್‌ಗಳು ಟೌನಲ್ಲಿ ಪುಷ್ಟೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ (ಸ್ಟೊಚಿಯೊಮೆಟ್ರಿ 0.5 ಕ್ಕಿಂತ ಕಡಿಮೆ, ಪ್ರತಿ ಒಟ್ಟು ಟೌ ಅಣುಗಳ ಸರಾಸರಿ ಸಂಖ್ಯೆಯು αS ಅಣುಗಳಿಗಿಂತ 4 ಪಟ್ಟು ಹೆಚ್ಚು), ಇದು ನಮ್ಮ ಸೈಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಗಮನಿಸಿದ FLIM ನಲ್ಲಿ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ. ಪ್ರಯೋಗಗಳು..FRET ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯು ಈ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳು ಎರಡೂ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಿದೆ, ಆದಾಗ್ಯೂ ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ ನಿಜವಾದ FRET ಮೌಲ್ಯಗಳು ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲ, ಏಕೆಂದರೆ ಪ್ರಯೋಗದಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾದ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡದ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಹೆಚ್ಚಿನ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ ಪ್ರತಿ ಒಟ್ಟು ಮೊತ್ತದಲ್ಲಿ ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್‌ಗಳ ವಿತರಣೆಯು ಯಾದೃಚ್ಛಿಕವಾಗಿದೆ.ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ನಾವು 45,46 ಪ್ರಬುದ್ಧ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆ-ಕೊರತೆಯ ಟೌ ರೂಪಾಂತರವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅದೇ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯನ್ನು ನಡೆಸಿದಾಗ (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ. 11a,b ಅನ್ನು ನೋಡಿ), αS ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯು ಒಂದೇ ಆಗಿದ್ದರೂ (ಸಪ್ಲಿಮೆಂಟರಿ ಫಿಗರ್. 11c, d) ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ನೊಳಗೆ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವು ತೀವ್ರವಾಗಿ ಕಡಿಮೆಯಾಯಿತು ಮತ್ತು FLIM ಸಿತು ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಹಲವಾರು ಸ್ಥಳಗಳನ್ನು ಪತ್ತೆಹಚ್ಚಿತು ಮತ್ತು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ ಒಟ್ಟು ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ ದುರ್ಬಲ ಅಡ್ಡ-ಸಂಬಂಧ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಯಿತು.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಕಡಿಮೆ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಪತ್ತೆಯಾದ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳಿಗೆ (Tau441 ನ ಹತ್ತನೇ ಒಂದು ಭಾಗ ಮಾತ್ರ), ಈ ಟೌ ರೂಪಾಂತರಕ್ಕಿಂತ ಪ್ರತಿ ಒಟ್ಟು ಮೊತ್ತವು αS ನಲ್ಲಿ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿದೆ ಎಂದು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ, ಸುಮಾರು 50% ಪತ್ತೆಯಾದ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳು ಕೇವಲ αS ಅಣುಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು αS ವಿಪರೀತವಾಗಿದೆ .ಸಮುಚ್ಚಯಗಳು (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 11e ನೋಡಿ), Tau441 (Fig. 6f) ನಿಂದ ಉತ್ಪತ್ತಿಯಾಗುವ ವೈವಿಧ್ಯಮಯ ಒಟ್ಟುಗಳಿಗೆ ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ.ಈ ಪ್ರಯೋಗಗಳ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು αS ಸ್ವತಃ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ನೊಳಗೆ ಟೌ ಜೊತೆಗೆ ಶೇಖರಗೊಳ್ಳುವ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರೂ, ಈ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಟೌ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೇಶನ್ ಹೆಚ್ಚು ಅನುಕೂಲಕರವಾಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್-ತರಹದ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳು αS ಮತ್ತು ಟೌನ ರೂಪವಾಗಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಒಮ್ಮೆ ಟೌ-ರಿಚ್ ಕೋರ್ ರೂಪುಗೊಂಡರೆ, ಟೌ ಅಣುಗಳ ನಡುವಿನ ಹೋಮೋಟೈಪಿಕ್ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ಮೇಲೆ αS ಮತ್ತು ಟೌ ನಡುವಿನ ಭಿನ್ನರೂಪದ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳು ಒಲವು ತೋರುತ್ತವೆ;ನಾವು ದ್ರವ αS/ಟೌ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ಗಳನ್ನು ಸಹ ಗಮನಿಸುತ್ತೇವೆ.
αS/Tau441 ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ರೂಪುಗೊಂಡ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳ ಏಕ ಅಣುಗಳ ಪ್ರತಿನಿಧಿ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತಾತ್ಕಾಲಿಕ ಕುರುಹುಗಳು.αS/Tau441 coaggregates ಗೆ ಅನುಗುಣವಾದ ಸ್ಫೋಟಗಳು (ಸೂಚಿತ ಮಿತಿಗಿಂತ ಮೇಲಿರುವ ಸ್ಫೋಟಗಳು) ಮೂರು ಪತ್ತೆ ಚಾನೆಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ (AF488 ಮತ್ತು Atto647N ನೇರ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ನಂತರ ಹೊರಸೂಸುವಿಕೆ, ನೀಲಿ ಮತ್ತು ಕೆಂಪು ಗೆರೆಗಳು, ಪರೋಕ್ಷ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ನಂತರ Atto647N ಹೊರಸೂಸುವಿಕೆ), FRET, ನೇರಳೆ ರೇಖೆ).b LLPS (ಎಡ ಫಲಕ) ನಿಂದ ಪಡೆದ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ αS/Tau441 ಒಟ್ಟುಗಳ ಮಾದರಿಯ FCS/FCCS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ.AF488 ಮತ್ತು Atto647N ಗಾಗಿ ಸ್ವಯಂ-ಸಂಬಂಧ (AC) ಕರ್ವ್‌ಗಳನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ ನೀಲಿ ಮತ್ತು ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಎರಡೂ ಬಣ್ಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿತವಾಗಿರುವ ಅಡ್ಡ-ಸಂಬಂಧ (CC) ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳನ್ನು ನೇರಳೆ ಬಣ್ಣದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.AC ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ ಮತ್ತು ಒಟ್ಟುಗೂಡಿದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಜಾತಿಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ, ಆದರೆ CC ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳು ಎರಡು-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಮಾತ್ರ ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.ಅದೇ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ, ಆದರೆ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ ಸ್ಥಳಗಳಲ್ಲಿ ಅದೇ ಪರಿಹಾರದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ, ಕೇವಲ ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ αS ಮತ್ತು Tau441 ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಬಲ ಫಲಕದಲ್ಲಿ ನಿಯಂತ್ರಣಗಳಾಗಿ ತೋರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.c αS/Tau441 ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ರೂಪುಗೊಂಡ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳ ಏಕ ಅಣುಗಳ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಫ್ಲ್ಯಾಷ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ.ನಾಲ್ಕು ವಿಭಿನ್ನ ಪುನರಾವರ್ತನೆಗಳಲ್ಲಿ (N = 152) ಕಂಡುಬರುವ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಮೊತ್ತದ ಮಾಹಿತಿಯನ್ನು ಅವುಗಳ ಸ್ಟೊಯಿಕಿಯೊಮೆಟ್ರಿ, S ಮೌಲ್ಯಗಳು ಮತ್ತು FRET ದಕ್ಷತೆಯ ವಿರುದ್ಧ ರೂಪಿಸಲಾಗಿದೆ (ಮೇಲಿನ ಫಲಕ, ಬಣ್ಣದ ಪಟ್ಟಿಯು ಸಂಭವಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ).ಮೂರು ವಿಧದ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಬಹುದು: -αS-ಮಾತ್ರ ಒಟ್ಟುಗಳು S~1 ಮತ್ತು FRET~0, Tau-ಮಾತ್ರ ಒಟ್ಟುಗಳು S~0 ಮತ್ತು FRET~1, ಮತ್ತು ಭಿನ್ನಜಾತಿಯ Tau/αS ಮೊತ್ತದ ಮಧ್ಯಂತರ S ಮತ್ತು FRET ಅಂದಾಜುಗಳು ಪ್ರತಿ ಭಿನ್ನಜಾತಿಯ ಒಟ್ಟು (N = 100) ನಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆಯಾದ ಎರಡೂ ಮಾರ್ಕರ್ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಕೆಳಗಿನ ಫಲಕದಲ್ಲಿ ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ (ಬಣ್ಣದ ಪ್ರಮಾಣವು ಸಂಭವಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರತಿಬಿಂಬಿಸುತ್ತದೆ).ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾವನ್ನು ಕಚ್ಚಾ ಡೇಟಾ ಫೈಲ್‌ಗಳ ರೂಪದಲ್ಲಿ ಒದಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.
ಕಾಲಾನಂತರದಲ್ಲಿ ಜೆಲ್ ತರಹದ ಅಥವಾ ಘನ ರಚನೆಗಳಾಗಿ ದ್ರವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ನ ಪಕ್ವವಾಗುವಿಕೆ ಅಥವಾ ವಯಸ್ಸಾದಿಕೆಯು ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ನ ಹಲವಾರು ಶಾರೀರಿಕ ಕ್ರಿಯೆಗಳಲ್ಲಿ ತೊಡಗಿಸಿಕೊಂಡಿದೆ ಎಂದು ವರದಿಯಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆ 7, 48, 49 ಕ್ಕೆ ಮುಂಚಿನ ಅಸಹಜ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಾಗಿದೆ. ನಾವು ಹಂತದ ಪ್ರತ್ಯೇಕತೆ ಮತ್ತು ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ವಿವರವಾಗಿ ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡುತ್ತೇವೆ.ಕಡಿಮೆ ಮೈಕ್ರೋಮೋಲಾರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳು ಮತ್ತು ಶಾರೀರಿಕವಾಗಿ ಸಂಬಂಧಿತ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ನಿಯಂತ್ರಿತ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ LSPT αS (αS ನ ಲೆಕ್ಕಾಚಾರದ ಶಾರೀರಿಕ ಸಾಂದ್ರತೆಯು >1 µM50 ಎಂದು ಗಮನಿಸಿ), LPS ನ ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಉಷ್ಣಬಲವಾಗಿ ಚಾಲಿತ ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ಅನುಸರಿಸುತ್ತದೆ.ಶಾರೀರಿಕ pH ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಋಣಾತ್ಮಕ ಆವೇಶದ C-ಟರ್ಮಿನಲ್ ಪ್ರದೇಶವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ αS, ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯ ಮೂಲಕ pLK ಅಥವಾ Tau ನಂತಹ ಹೆಚ್ಚು ಕ್ಯಾಟಯಾನಿಕ್ ಅಸ್ವಸ್ಥತೆಯ ಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ LLPS ಮೂಲಕ ಜಲೀಯ ದ್ರಾವಣದಲ್ಲಿ ಪ್ರೋಟೀನ್-ಭರಿತ ಹನಿಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ನಾವು ಕಂಡುಕೊಂಡಿದ್ದೇವೆ. ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯ ಮ್ಯಾಕ್ರೋಮಾಲಿಕ್ಯೂಲ್ಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಸಂಕೀರ್ಣ ಘನೀಕರಣ.ಈ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಸೆಲ್ಯುಲಾರ್ ಪರಿಸರದಲ್ಲಿ ಸಂಬಂಧಿತ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರಬಹುದು, ಅಲ್ಲಿ αS ಅದರ ರೋಗ-ಸಂಬಂಧಿತ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ವಿವಿಧ ಪಾಲಿಕೇಷನ್ ಅಣುಗಳನ್ನು ವಿಟ್ರೊ ಮತ್ತು vivo51,52,53,54 ನಲ್ಲಿ ಎದುರಿಸುತ್ತದೆ.
ಅನೇಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳಲ್ಲಿ, ಹನಿಗಳೊಳಗಿನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಡೈನಾಮಿಕ್ಸ್ ಪಕ್ವತೆಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸುವ ಪ್ರಮುಖ ಅಂಶಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದೆಂದು ಪರಿಗಣಿಸಲಾಗಿದೆ55,56.ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ αS ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ, ಪಕ್ವತೆಯ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯು ಸ್ಪಷ್ಟವಾಗಿ ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳೊಂದಿಗಿನ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ಶಕ್ತಿ, ವೇಲೆನ್ಸಿ ಮತ್ತು ಈ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ಬಹುಸಂಖ್ಯೆಯ ಮೇಲೆ ಅವಲಂಬಿತವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಎರಡು ದ್ರವ ಸ್ಥಿತಿಗಳ ಸಮತೋಲನ ಭೂದೃಶ್ಯವು LLPS57,58 ಅನ್ನು ಚಾಲನೆ ಮಾಡುವ ಬಯೋಪಾಲಿಮರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಮೃದ್ಧವಾಗಿರುವ ದೊಡ್ಡ ಹನಿಯ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸಮತೋಲನ ಸಿದ್ಧಾಂತವು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ಹನಿಗಳ ಬೆಳವಣಿಗೆಯನ್ನು ಓಸ್ಟ್ವಾಲ್ಡ್ ಪಕ್ವತೆ 59, ಕೋಲೆಸೆನ್ಸ್ 60 ಅಥವಾ ಚದುರಿದ ಹಂತ 61 ರಲ್ಲಿ ಉಚಿತ ಮೊನೊಮರ್ ಸೇವನೆಯಿಂದ ಸಾಧಿಸಬಹುದು.αS ಮತ್ತು Tau441, ΔNt-Tau ಅಥವಾ pLK ಗಾಗಿ, ಈ ಅಧ್ಯಯನದಲ್ಲಿ ಬಳಸಿದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರೀಕೃತವಾಗಿರುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಮೇಲ್ಮೈ ತೇವಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯ ಮೇಲೆ ಪೂರ್ಣ-ಗಾತ್ರದ ಟೌ ಹನಿಗಳು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಒಗ್ಗೂಡಿಸಲ್ಪಟ್ಟಾಗ, ಹನಿಗಳ ಸಂಯೋಜನೆ ಮತ್ತು ತೇವಗೊಳಿಸುವಿಕೆಯು ΔNt-Tau ಮತ್ತು pLK ಗೆ ಕಷ್ಟಕರವಾಗಿತ್ತು, ಈ ಎರಡು ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳಲ್ಲಿ ದ್ರವ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳ ತ್ವರಿತ ನಷ್ಟವನ್ನು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.ನಮ್ಮ FLIM-FRET ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯ ಪ್ರಕಾರ, ವಯಸ್ಸಾದ pLK ಮತ್ತು ΔNt-Tau ಹನಿಗಳು ಮೂಲ ಹನಿಗಳಂತೆಯೇ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯ (ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಜೀವಿತಾವಧಿ) ತೋರಿಸಿದವು, ಮೂಲ ಪ್ರೋಟೀನ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್ ಅನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ಕಠಿಣವಾಗಿದ್ದರೂ ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ ಎಂದು ಸೂಚಿಸುತ್ತದೆ.
ನಾವು ಈ ಕೆಳಗಿನ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ನಮ್ಮ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳನ್ನು ತರ್ಕಬದ್ಧಗೊಳಿಸುತ್ತೇವೆ (ಚಿತ್ರ 8).ಆರಂಭದಲ್ಲಿ ತಾತ್ಕಾಲಿಕವಾಗಿ ರೂಪುಗೊಂಡ ಹನಿಗಳು ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಪರಿಹಾರವಿಲ್ಲದೆ ಪ್ರೋಟೀನ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ಗಳಾಗಿವೆ ಮತ್ತು ಹೀಗಾಗಿ ಚಾರ್ಜ್ ಅಸಮತೋಲನದ ಪ್ರದೇಶಗಳಿವೆ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಹನಿ ಇಂಟರ್‌ಫೇಸ್‌ನಲ್ಲಿ, ಹೆಚ್ಚಿನ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಮೇಲ್ಮೈ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದೊಂದಿಗೆ ಹನಿಗಳು ಉಂಟಾಗುತ್ತವೆ.ಚಾರ್ಜ್ ಅನ್ನು ಸರಿದೂಗಿಸಲು (ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ವೇಲೆನ್ಸಿ ಡಿಪ್ಲೀಷನ್ ಎಂದು ಕರೆಯಲ್ಪಡುವ ವಿದ್ಯಮಾನ) ಮತ್ತು ಹನಿಗಳ ಮೇಲ್ಮೈ ಸಂಭಾವ್ಯತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು, ಹನಿಗಳು ದುರ್ಬಲ ಹಂತದಿಂದ ಹೊಸ ಪಾಲಿಪೆಪ್ಟೈಡ್‌ಗಳನ್ನು ಸೇರಿಸಿಕೊಳ್ಳಬಹುದು, ಚಾರ್ಜ್-ಚಾರ್ಜ್ ಸಂವಹನಗಳನ್ನು ಉತ್ತಮಗೊಳಿಸಲು ಪ್ರೋಟೀನ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ಗಳನ್ನು ಮರುಸಂಘಟಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಇತರ ಹನಿಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂವಹನ ನಡೆಸಬಹುದು.ಮೇಲ್ಮೈಗಳೊಂದಿಗೆ (ತೇವಗೊಳಿಸುವಿಕೆ).αS/pLK ಹನಿಗಳು, ಅವುಗಳ ಸರಳವಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್ (αS ಮತ್ತು pLK ನಡುವಿನ ಹೆಟೆರೊಟೈಪಿಕ್ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳು) ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್-ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಬಾಂಧವ್ಯದಿಂದಾಗಿ, ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ನ ಚಾರ್ಜ್ ಅನ್ನು ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಸಮತೋಲನಗೊಳಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ತೋರುತ್ತದೆ;ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, αS/Tau ಗಿಂತ ಆರಂಭದಲ್ಲಿ ರೂಪುಗೊಂಡ αS/pLK ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ನಾವು ವೇಗವಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಚಲನಶಾಸ್ತ್ರವನ್ನು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ.ವೇಲೆನ್ಸಿ ಸವಕಳಿಯಾದ ನಂತರ, ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳು ಕಡಿಮೆ ಅಲ್ಪಕಾಲಿಕವಾಗುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಹನಿಗಳು ತಮ್ಮ ದ್ರವ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಕಳೆದುಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಮೇಲ್ಮೈ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದೊಂದಿಗೆ (ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ಮೇಲ್ಮೈಯನ್ನು ತೇವಗೊಳಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುವುದಿಲ್ಲ) ಜೆಲ್ ತರಹದ, ದಹಿಸಲಾಗದ ಹನಿಗಳಾಗಿ ಬದಲಾಗುತ್ತವೆ.ಇದಕ್ಕೆ ವ್ಯತಿರಿಕ್ತವಾಗಿ, αS/Tau ಹನಿಗಳು ಹೆಚ್ಚು ಸಂಕೀರ್ಣವಾದ ಪ್ರೋಟೀನ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ಗಳಿಂದ (ಹೋಮೋಟೈಪಿಕ್ ಮತ್ತು ಹೆಟೆರೊಟೈಪಿಕ್ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳೊಂದಿಗೆ) ಮತ್ತು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳ ದುರ್ಬಲ ಸ್ವಭಾವದಿಂದಾಗಿ ಹನಿ ಚಾರ್ಜ್ ಬ್ಯಾಲೆನ್ಸ್ ಅನ್ನು ಉತ್ತಮಗೊಳಿಸುವಲ್ಲಿ ಕಡಿಮೆ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ.ಇದು ದೀರ್ಘಕಾಲದವರೆಗೆ ದ್ರವ ವರ್ತನೆಯನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳುವ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಮೇಲ್ಮೈ ಸಾಮರ್ಥ್ಯವನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುವ ಹನಿಗಳಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಇದು ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಬೆಳೆಯುವ ಮೂಲಕ (ಹೀಗಾಗಿ ಮೇಲ್ಮೈ ವಿಸ್ತೀರ್ಣ/ಹನಿಗಳ ಪರಿಮಾಣದ ಅನುಪಾತವನ್ನು ಕಡಿಮೆಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ) ಮತ್ತು ಹೈಡ್ರೋಫಿಲಿಕ್ ಮೇಲ್ಮೈ ಕೆಮ್ ಅನ್ನು ತೇವಗೊಳಿಸುವುದರ ಮೂಲಕ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ.ಇದು ಪ್ರೋಟೀನ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ನಲ್ಲಿ ಚಾರ್ಜ್ ಆಪ್ಟಿಮೈಸೇಶನ್‌ಗಾಗಿ ನಿರಂತರ ಹುಡುಕಾಟದಿಂದಾಗಿ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳು ಬಹಳ ಕ್ಷಣಿಕವಾಗಿ ಉಳಿಯುವುದರಿಂದ ದ್ರವ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳುವ ದೊಡ್ಡ ಕೇಂದ್ರೀಕೃತ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಲೈಬ್ರರಿಗಳನ್ನು ರಚಿಸುತ್ತದೆ.ಕುತೂಹಲಕಾರಿಯಾಗಿ, ಕೆಲವು ನೈಸರ್ಗಿಕವಾಗಿ ಸಂಭವಿಸುವ ಐಸೊಫಾರ್ಮ್‌ಗಳು62 ಸೇರಿದಂತೆ ಟೌನ N-ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಮೊಟಕುಗೊಳಿಸಿದ ರೂಪಗಳು ಮಧ್ಯಂತರ ನಡವಳಿಕೆಯನ್ನು ಪ್ರದರ್ಶಿಸುತ್ತವೆ, ಕೆಲವು ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳು αS ನೊಂದಿಗೆ ವಯಸ್ಸಾದ ದೀರ್ಘಾವಧಿಯ ಜೆಲ್ ತರಹದ ಹನಿಗಳಾಗಿ, ಇತರವುಗಳು ದೊಡ್ಡ ದ್ರವ ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ಗಳಾಗಿ ರೂಪಾಂತರಗೊಳ್ಳುತ್ತವೆ.αS ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳ ಪಕ್ವತೆಯ ಈ ದ್ವಂದ್ವತೆಯು ಇತ್ತೀಚಿನ LLPS ಸೈದ್ಧಾಂತಿಕ ಮತ್ತು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಥಿರವಾಗಿದೆ, ಇದು ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್ ಗಾತ್ರ ಮತ್ತು ದ್ರವ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಕೀಲಿಯಾಗಿ ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವೇಲೆನ್ಸಿ ಡಿಪ್ಲೀಷನ್ ಮತ್ತು ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಜರಡಿ ನಡುವಿನ ಪರಸ್ಪರ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಗುರುತಿಸಿದೆ.ಯಾಂತ್ರಿಕತೆ 58.61.
ಈ ಯೋಜನೆಯು LLPS ಮತ್ತು LSPT ಮೂಲಕ αS ಮತ್ತು Tau441 ಗಾಗಿ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯ ಮಾರ್ಗವನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಅಯಾನು-ಸಮೃದ್ಧ (ಕೆಂಪು) ಮತ್ತು ಕ್ಯಾಷನ್-ಸಮೃದ್ಧ (ನೀಲಿ) ಪ್ರದೇಶಗಳೊಂದಿಗೆ, ತೃಪ್ತಿಕರ ವೇಲೆನ್ಸಿಯೊಂದಿಗೆ αS ಮತ್ತು ಟೌ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳು ಕಡಿಮೆ ಮೇಲ್ಮೈ ಶಕ್ತಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ ಕಡಿಮೆ ಒಗ್ಗೂಡುವಿಕೆ, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ತ್ವರಿತ ಹನಿ ವಯಸ್ಸಾಗುವಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.ಸ್ಥಿರವಾದ ಅಲ್ಲದ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸಲ್ಪಟ್ಟ ಜೆಲ್ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಸಾಧಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ..ಈ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಯು αS/pLK ವ್ಯವಸ್ಥೆಯ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ ಅದರ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಂಬಂಧ ಮತ್ತು ಸರಳವಾದ ಪ್ರೊಟೀನ್-ಜೋಡಿ ಸಂವಹನ ಜಾಲದಿಂದಾಗಿ ಬಹಳ ಅನುಕೂಲಕರವಾಗಿದೆ, ಇದು ವೇಗದ ಜೆಲ್ ತರಹದ ಪರಿವರ್ತನೆಗೆ ಅನುವು ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ.ಇದಕ್ಕೆ ತದ್ವಿರುದ್ಧವಾಗಿ, ಅತೃಪ್ತಿಕರ ವೇಲೆನ್ಸಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಹನಿಗಳು ಮತ್ತು ಆದ್ದರಿಂದ, ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗೆ ಲಭ್ಯವಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್-ಚಾರ್ಜ್ಡ್ ಪ್ರದೇಶಗಳು, ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗೆ ಅದರ ಹೆಚ್ಚಿನ ಮೇಲ್ಮೈ ಶಕ್ತಿಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಲು ಹೈಡ್ರೋಫಿಲಿಕ್ ಮೇಲ್ಮೈಯನ್ನು ಬೆಸೆಯಲು ಮತ್ತು ಒದ್ದೆ ಮಾಡಲು ಸುಲಭಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ.ದುರ್ಬಲ ಟೌ-ಟೌ ಮತ್ತು αS-ಟೌ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಮಲ್ಟಿವೇಲೆಂಟ್ ಸಂಕೀರ್ಣ ಜಾಲವನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ αS/Tau441 ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಈ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಯು ಯೋಗ್ಯವಾಗಿದೆ.ಪ್ರತಿಯಾಗಿ, ದೊಡ್ಡ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳು ತಮ್ಮ ದ್ರವದಂತಹ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ಸುಲಭವಾಗಿ ಉಳಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ, ಇದು ಇತರ ಪ್ರೋಟೀನ್-ಟು-ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳಿಗೆ ಅವಕಾಶ ನೀಡುತ್ತದೆ.ಅಂತಿಮವಾಗಿ, ಕೋಸರ್ವೇಟ್ ದ್ರವದೊಳಗೆ αS ಮತ್ತು ಟೌ ಎರಡನ್ನೂ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಭಿನ್ನಜಾತಿ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳು, ನ್ಯೂರೋ ಡಿಜೆನೆರೆಟಿವ್ ಕಾಯಿಲೆಗಳ ವಿಶಿಷ್ಟ ಲಕ್ಷಣಗಳಾದ ಇನ್‌ಕ್ಲೂಷನ್ ಬಾಡಿಗಳಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಅಂಶಗಳಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿರಬಹುದು.
αS/Tau441 ನ ಪಕ್ವತೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ರೂಪುಗೊಂಡ ದೊಡ್ಡ ದ್ರವದಂತಹ ರಚನೆಗಳು ಹೆಚ್ಚು ದಟ್ಟಣೆಯ ಆದರೆ ಕ್ರಿಯಾತ್ಮಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪರಿಸರದೊಂದಿಗೆ ಮತ್ತು ಸ್ವಲ್ಪ ಮಟ್ಟಿಗೆ, αS/ΔNt-Tau ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೇಶನ್‌ಗೆ ಸೂಕ್ತವಾದ ಜಲಾಶಯಗಳಾಗಿವೆ.ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ αS ಮತ್ತು ಟೌ ಎರಡನ್ನೂ ಒಳಗೊಂಡಿರುವ ಈ ರೀತಿಯ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಘನ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ನಾವು ಗಮನಿಸಿದ್ದೇವೆ.ಈ ಹೆಟೆರೊಗ್ರೆಗೇಟ್‌ಗಳು ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನವಲ್ಲದ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳಿಂದ ಸ್ಥಿರವಾಗಿರುತ್ತವೆ ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸಿದ್ದೇವೆ, ವಿಶಿಷ್ಟವಾದ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳಂತೆಯೇ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್-ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ThT ಬಣ್ಣಗಳನ್ನು ಬಂಧಿಸಲು ಸಾಧ್ಯವಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ವಾಸ್ತವವಾಗಿ ವಿವಿಧ ಪ್ರಭಾವಗಳಿಗೆ ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಪ್ರತಿರೋಧವನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ.LLPS ನಿಂದ ರೂಪುಗೊಂಡ αS/ಟೌ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳು ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್-ತರಹದ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ ಎಂದು ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.ವಾಸ್ತವವಾಗಿ, ದ್ರವ ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ನೊಳಗೆ ಈ ವೈವಿಧ್ಯಮಯ αS ಸಮುಚ್ಚಯಗಳ ರಚನೆಯಲ್ಲಿ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯಲ್ಲಿ ಟೌ ಕೊರತೆಯ ಪ್ರೌಢ ರೂಪಾಂತರವು ಗಮನಾರ್ಹವಾಗಿ ದುರ್ಬಲಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ.αS/Tau441 ಸಮುಚ್ಚಯಗಳ ರಚನೆಯನ್ನು ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳ ಒಳಗೆ ಮಾತ್ರ ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ, ಇದು ದ್ರವದಂತಹ ಗುಣಲಕ್ಷಣಗಳನ್ನು ಉಳಿಸಿಕೊಂಡಿದೆ ಮತ್ತು ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳು/ಹನಿಗಳು ಜೆಲ್ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ತಲುಪದಿದ್ದರೆ ಎಂದಿಗೂ.ನಂತರದ ಪ್ರಕರಣದಲ್ಲಿ, ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಸಂವಹನಗಳ ಹೆಚ್ಚಿದ ಶಕ್ತಿ ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ, ಪ್ರೋಟೀನ್ ಜಾಲದ ಬಿಗಿತವು ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೇಶನ್‌ಗೆ ಅಗತ್ಯವಾದ ಹೊಸ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪರಸ್ಪರ ಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಸ್ಥಾಪಿಸಲು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಅಗತ್ಯ ಅನುರೂಪ ಮರುಜೋಡಣೆಗಳನ್ನು ತಡೆಯುತ್ತದೆ.ಆದಾಗ್ಯೂ, ಇದನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ಹೊಂದಿಕೊಳ್ಳುವ, ದ್ರವ-ತರಹದ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸಾಧಿಸಬಹುದು, ಅವು ಗಾತ್ರದಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚಾದಂತೆ ದ್ರವವಾಗಿ ಉಳಿಯುವ ಸಾಧ್ಯತೆ ಹೆಚ್ಚು.
ಕ್ಷಿಪ್ರವಾಗಿ ಜೆಲ್ ಆಗುವ ಸಣ್ಣ ಹನಿಗಳಿಗಿಂತ ದೊಡ್ಡ αS/ಟೌ ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಮಂದಗೊಳಿಸಿದ ಹಂತದೊಳಗೆ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳ ರಚನೆಯು ಯೋಗ್ಯವಾಗಿದೆ ಎಂಬ ಅಂಶವು ಹನಿಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸುವ ಅಂಶಗಳನ್ನು ಗುರುತಿಸುವ ಪ್ರಸ್ತುತತೆಯನ್ನು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.ಹೀಗಾಗಿ, ಹಂತ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆಗೆ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯು ಮಾತ್ರವಲ್ಲದೆ, ಸರಿಯಾದ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಣೆಗಾಗಿ ಮತ್ತು ರೋಗ ತಡೆಗಟ್ಟುವಿಕೆಗಾಗಿ ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್ನ ಗಾತ್ರವನ್ನು ನಿಯಂತ್ರಿಸಬೇಕು58,61.αS/Tau ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಾಗಿ LLPS ಮತ್ತು LSPT ನಡುವಿನ ಸಮತೋಲನದ ಪ್ರಾಮುಖ್ಯತೆಯನ್ನು ನಮ್ಮ ಫಲಿತಾಂಶಗಳು ಎತ್ತಿ ತೋರಿಸುತ್ತವೆ.ಸಣ್ಣಹನಿಗಳ ರಚನೆಯು ಸ್ಯಾಚುರೇಶನ್ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಲಭ್ಯವಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಮೊನೊಮರ್‌ಗಳ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯಿಂದ ರಕ್ಷಿಸಬಹುದು, ಇತರ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸಲಾಗಿದೆ63,64, ಹೆಚ್ಚಿನ ಹನಿಗಳ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಸಣ್ಣಹನಿಗಳ ಸಮ್ಮಿಳನವು ನಿಧಾನ ಹೊಂದಾಣಿಕೆಯ ಮರುಜೋಡಣೆಗಳ ಮೂಲಕ ಆಂತರಿಕ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡುವಿಕೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು.ಪ್ರೋಟೀನ್ ಜಾಲಗಳು..
ಒಟ್ಟಾರೆಯಾಗಿ, ನಮ್ಮ ಡೇಟಾವು ಎಲ್‌ಎಸ್‌ಪಿಟಿಯ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ ಡ್ರಾಪ್ ನೆಟ್‌ವರ್ಕ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಸುಸಂಬದ್ಧ ವೇಲೆನ್ಸಿ ಮತ್ತು ತೃಪ್ತಿ/ಅತೃಪ್ತ ಸಂವಹನಗಳ ಪ್ರಸ್ತುತತೆಯನ್ನು ಬಲವಾಗಿ ಒತ್ತಿಹೇಳುತ್ತದೆ.ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ಹೇಳುವುದಾದರೆ, ಪೂರ್ಣ-ಉದ್ದದ αS/Tau441 ಕಂಡೆನ್ಸೇಟ್‌ಗಳು ಪರಿಣಾಮಕಾರಿಯಾಗಿ ಫ್ಯೂಸ್ ಮಾಡಲು ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯೇಟ್ ಮಾಡಲು ಸಮರ್ಥವಾಗಿವೆ ಎಂದು ನಾವು ತೋರಿಸುತ್ತೇವೆ, ಅದು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ನಮ್ಮ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ಆಣ್ವಿಕ ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸುತ್ತದೆ.ನಾವು ಇಲ್ಲಿ ವರದಿ ಮಾಡುವ αS/Tau ಫ್ಲೂಯಿಡ್ ಕೋಸರ್ವೇಟ್‌ನಲ್ಲಿನ ಎರಡು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಸಹ-ಒಗ್ಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯು ವಾಸ್ತವವಾಗಿ ಸೇರ್ಪಡೆಗಳಲ್ಲಿನ ಎರಡು ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳ ಸಹ-ಸ್ಥಳೀಕರಣಕ್ಕೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿರಬಹುದು, ಇದು ರೋಗದ ವಿಶಿಷ್ಟ ಲಕ್ಷಣಗಳಾಗಿವೆ ಮತ್ತು LLPS ಮತ್ತು ನಡುವಿನ ಸಂಬಂಧವನ್ನು ಅರ್ಥಮಾಡಿಕೊಳ್ಳಲು ಕೊಡುಗೆ ನೀಡಬಹುದು. ಅಮಿಲಾಯ್ಡ್ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆ, ನ್ಯೂರೋ ಡಿಜೆನರೇಶನ್‌ನಲ್ಲಿ ಹೆಚ್ಚು ಚಾರ್ಜ್ಡ್ ಐಡಿಪಿಗೆ ದಾರಿ ಮಾಡಿಕೊಡುತ್ತದೆ.
ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ WT-αS, ಸಿಸ್ಟೀನ್ ಮ್ಯುಟೆಂಟ್ಸ್ (Q24C-αS, N122C-αS) ಮತ್ತು ΔCt-αS ರೂಪಾಂತರಗಳು (Δ101-140) E. ಕೊಲಿಯಲ್ಲಿ ವ್ಯಕ್ತಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಹಿಂದೆ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಶುದ್ಧೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಡೈಸಲ್ಫೈಡ್ ಬಂಧ ರಚನೆಯನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು αS ಸಿಸ್ಟೀನ್ ರೂಪಾಂತರಿತ ವಸ್ತುಗಳ ಶುದ್ಧೀಕರಣದ ಎಲ್ಲಾ ಹಂತಗಳಲ್ಲಿ 5 mM DTT ಅನ್ನು ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ.Tau441 ಐಸೊಫಾರ್ಮ್ (ಆಡ್‌ಜೀನ್ #16316 ರಿಂದ ಪ್ಲಾಸ್ಮಿಡ್ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ), ΔNt-Tau ರೂಪಾಂತರ (Δ1–150, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ IVA ಅನ್ನು ಕ್ಲೋನಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACGCGG, CATGTATATCCTCTCTTCTTAA-1vari AggTAEF (3Δ5AGTTAA) GGCTC5 ಪ್ರೈಮರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸಂಯೋಜಿಸಲಾಗಿದೆ) E. ಕೊಲಿ ಸಂಸ್ಕೃತಿಗಳು 37 ° C ಮತ್ತು 180 rpm ನಲ್ಲಿ OD600 = 0.6-0.7 ಗೆ ಬೆಳೆದಿದೆ ಮತ್ತು 37 ° C ನಲ್ಲಿ 3 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ IPTG ಯೊಂದಿಗೆ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯನ್ನು ಪ್ರಚೋದಿಸಲಾಗಿದೆ.4 °C ನಲ್ಲಿ 15 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 11,500 xg ಯಲ್ಲಿ ಕೋಶಗಳನ್ನು ಕೊಯ್ಲು ಮಾಡಿ ಮತ್ತು 150 mM NaCl ಹೊಂದಿರುವ ಸಲೈನ್ ಬಫರ್‌ನಿಂದ ತೊಳೆಯಿರಿ.ಲೈಸಿಸ್ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಪೆಲೆಟ್ ಅನ್ನು ಮರುಹೊಂದಿಸಿ (1 L LB ಗೆ 20 ಮಿಲಿ: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, ಬೆಂಜಮಿಡಿನ್ 50 μM1, copeptin 50 μM1,ಸೋನಿಕೇಶನ್ ಹಂತವನ್ನು 10 ದ್ವಿದಳ ಧಾನ್ಯಗಳಿಗೆ 80% ವೈಶಾಲ್ಯದೊಂದಿಗೆ ಐಸ್‌ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು (1 ನಿಮಿಷ ಆನ್, 1 ನಿಮಿಷ ಆಫ್).ಒಂದು ಅಲ್ಟ್ರಾಸೌಂಡ್ನಲ್ಲಿ 60 ಮಿಲಿ ಮೀರಬಾರದು.E. ಕೊಲಿ ಲೈಸೇಟ್‌ಗಳನ್ನು 20 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 95 ° C. ನಲ್ಲಿ ಬಿಸಿಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ, ನಂತರ ಮಂಜುಗಡ್ಡೆಯ ಮೇಲೆ ತಂಪಾಗಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 40 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 127,000×g ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಸ್ಪಷ್ಟೀಕರಿಸಿದ ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್ ಅನ್ನು 3.5 kDa ಮೆಂಬರೇನ್‌ಗೆ (ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್™ ಥರ್ಮೋ ಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, UK) ಅನ್ವಯಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 4 L ಡಯಾಲಿಸಿಸ್ ಬಫರ್ ವಿರುದ್ಧ ಡಯಾಲೈಸ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 m2 mM, DTT, MGM, MG2 , PMSF 0.1 mM) 10 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾಲ.5 ಮಿಲಿ ಕ್ಯಾಶನ್ ವಿನಿಮಯ ಕಾಲಮ್ (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) ಸಮೀಕರಣ ಬಫರ್ (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 m.ಟೌ ಲೈಸೇಟ್ ಅನ್ನು 0.22 μm PVDF ಫಿಲ್ಟರ್ ಮೂಲಕ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 1 ಮಿಲಿ / ನಿಮಿಷದ ಹರಿವಿನ ದರದಲ್ಲಿ ಕಾಲಮ್‌ಗೆ ಚುಚ್ಚಲಾಗುತ್ತದೆ.ಎಲುಶನ್ ಅನ್ನು ಕ್ರಮೇಣವಾಗಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ಟೌ ಅನ್ನು 15-30% ಎಲುಷನ್ ಬಫರ್ (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) ನೊಂದಿಗೆ ಹೊರಹಾಕಲಾಯಿತು.ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳನ್ನು SDS-PAGE ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಿದೆ, ಮತ್ತು ಟೌನ ನಿರೀಕ್ಷಿತ ಆಣ್ವಿಕ ತೂಕದೊಂದಿಗೆ ಒಂದು ಬ್ಯಾಂಡ್ ಹೊಂದಿರುವ ಯಾವುದೇ ಭಿನ್ನರಾಶಿಗಳನ್ನು 10 kDa ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಜ್ ಫಿಲ್ಟರ್ ಬಳಸಿ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM ಮತ್ತು DTT 2 mM ಅನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಬಫರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಲಾಗಿದೆ. ಅಂತಿಮ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯು 100 μM ಆಗಿತ್ತು.ಪ್ರೋಟೀನ್ ದ್ರಾವಣವನ್ನು ನಂತರ 0.22 μm PVDF ಫಿಲ್ಟರ್ ಮೂಲಕ ರವಾನಿಸಲಾಯಿತು, ತ್ವರಿತವಾಗಿ ಫ್ರೀಜ್ ಮಾಡಿ ಮತ್ತು -80 ° C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರೊಟೀನ್ K18 ಅನ್ನು ಪ್ರೊ. ಆಲ್ಬರ್ಟೊ ಬೋಫಿ ಅವರು ದಯೆಯಿಂದ ಒದಗಿಸಿದ್ದಾರೆ.SDS-PAGE ಮತ್ತು MALDI-TOF/TOF ಮೂಲಕ ದೃಢೀಕರಿಸಿದಂತೆ ತಯಾರಿಕೆಯ ಶುದ್ಧತೆ >95% ಆಗಿತ್ತು.ವಿವಿಧ ಸಿಸ್ಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ರಾಸಾಯನಿಕವಾಗಿ ಅಲೆಕ್ಸಾಫ್ಲುಯರ್488-ಮ್ಯಾಲಿಮೈಡ್ (AF488, ಥರ್ಮೋಫಿಶರ್ ಸೈಂಟಿಫಿಕ್, ವಾಲ್ಥಮ್, MA, USA) ಅಥವಾ TEMPOL-maleimide (ಟೊರೊಂಟೊ ರಿಸರ್ಚ್ ಕೆಮಿಕಲ್ಸ್, ಟೊರೊಂಟೊ, ಕೆನಡಾ) ಎಂದು ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆ ಮತ್ತು MALDI-TOF/TOF ಮೂಲಕ ದೃಢೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau ಮತ್ತು K18 ಅನ್ನು ಅದೇ ವಿಧಾನವನ್ನು ಅನುಸರಿಸಿ Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, ಜರ್ಮನಿ) ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು 191 ಮತ್ತು 322 ಸ್ಥಾನಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ಥಳೀಯ ಸಿಸ್ಟೈನ್ ಅವಶೇಷಗಳೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.CIDER66 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು αS ಮತ್ತು Tau441 ಗಾಗಿ ಪ್ರತಿ ಶೇಷ ನಕ್ಷೆಗಳಿಗೆ ನಿವ್ವಳ ಶುಲ್ಕವನ್ನು ರಚಿಸಲಾಗಿದೆ.
ಸಾಲಿಡ್ ಪಾಲಿ-ಎಲ್-ಲೈಸಿನ್ (ಪೂರೈಕೆದಾರರಿಂದ NMR ಪ್ರಕಾರ pLK DP 90-110, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 ರಿಂದ 10 mM ಸಾನಿಕೇಟೆಡ್ ಸಾಂದ್ರತೆ, 5 ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಕರಗಿತು ಅಲ್ಟ್ರಾಸಾನಿಕ್ ನೀರಿನ ಸ್ನಾನದಲ್ಲಿ ನಿಮಿಷಗಳು ಮತ್ತು -20 ° C ನಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಿ.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) ಮತ್ತು FITC-dextran-500 (ಸಿಗ್ಮಾ -ಆಲ್ಡ್ರಿಚ್, ಸ್ಯಾಂಟ್ ಲೂಯಿಸ್, MI, USA) ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಕರಗುವ ಮತ್ತು LLPS ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ವ್ಯಾಪಕವಾಗಿ ವಿತರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಡಯಾಲಿಸಿಸ್ ಕಲುಷಿತ ಲವಣಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕುತ್ತದೆ.ನಂತರ ಅವುಗಳನ್ನು 0.22 μm ರಂಧ್ರದ ಗಾತ್ರದೊಂದಿಗೆ ಸಿರಿಂಜ್ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮೂಲಕ ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಅವುಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ರಿಫ್ರಾಕ್ಟೋಮೀಟರ್ (ಮೆಟ್ಲರ್ ಟೊಲೆಡೊ, ಕೊಲಂಬಸ್, ಓಹಿಯೋ, USA) ಬಳಸಿ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.LLPS ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಈ ಕೆಳಗಿನ ಕ್ರಮದಲ್ಲಿ ತಯಾರಿಸಲಾಗಿದೆ: ಬಫರ್ ಮತ್ತು ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆಯನ್ನು ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು 1 mM ಟ್ರಿಸ್ (2-ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಥೈಲ್) ಫಾಸ್ಫೈನ್ (TCEP, ಕಾರ್ಬೋಸಿಂತ್, ಕಾಂಪ್ಟನ್, UK), 1 mM 2,2,2,2-(ಇಥೇನ್- 1, 2-ಡೈಲ್ಡಿನಿಟ್ರೈಲ್) ಟೆಟ್ರಾಸೆಟಿಕ್ ಆಮ್ಲ (EDTA, ಕಾರ್ಬಾಕ್ಸಿಂತ್) ಮತ್ತು 1% ಪ್ರೋಟೀಸ್ ಪ್ರತಿರೋಧಕದ ಮಿಶ್ರಣ (PMSF 100 mM, ಬೆಂಜಿಮೈಡ್ 1 mM, ಲ್ಯುಪೆಪ್ಟಿನ್ 5 μM).ನಂತರ αS ಮತ್ತು ಫ್ಯೂಸ್ಡ್ ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳನ್ನು (ಆಯ್ಕೆಗಳು pLK ಅಥವಾ ಟೌ) ಸೇರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಥಿಯೋಫ್ಲಾವಿನ್-ಟಿ ಸಮಯ ಸರಣಿಯ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ (ThT, ಕಾರ್ಬೋಸಿಂತ್, ಕಾಂಪ್ಟನ್, UK), ಒಟ್ಟು ThT ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಅರ್ಧ αS ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ ಬಳಸಿ.ಮಾದರಿಗಳು ಏಕರೂಪತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸಿಕೊಳ್ಳಲು ನಿಧಾನವಾಗಿ ಆದರೆ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಮಿಶ್ರಣ ಮಾಡಿ.ಫಲಿತಾಂಶಗಳ ವಿಭಾಗದಲ್ಲಿ ವಿವರಿಸಿದಂತೆ ಪ್ರತಿಯೊಂದು ಘಟಕದ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಪ್ರಯೋಗದಿಂದ ಪ್ರಯೋಗಕ್ಕೆ ಬದಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರಯೋಗದ ಅವಧಿಯು 4 ಗಂಟೆಗಳನ್ನು ಮೀರಿದಾಗಲೆಲ್ಲಾ ಅಝೈಡ್ ಅನ್ನು 0.02% (w/v) ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.LLPS ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಬಳಸುವ ಎಲ್ಲಾ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಳಿಗೆ, ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗೆ 5 ನಿಮಿಷಗಳ ಮೊದಲು ಮಿಶ್ರಣವನ್ನು ಸಮೀಕರಿಸಲು ಅನುಮತಿಸಿ.ಬೆಳಕಿನ ಸ್ಕ್ಯಾಟರಿಂಗ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, 150 µl ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಬಂಧಿಸದ 96-ವೆಲ್ ಮೈಕ್ರೊಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಲೋಡ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ (µClear®, ಕಪ್ಪು, F-ಬಾಟಮ್/ಚಿಮಿನಿ ವೆಲ್, ಗ್ರೀನರ್ ಬಯೋ-ಒನ್, Kremsmünster, ಆಸ್ಟ್ರಿಯಾ) ಮತ್ತು ಅಂಟಿಕೊಳ್ಳುವ ಫಿಲ್ಮ್‌ನಿಂದ ಮುಚ್ಚಲಾಗುತ್ತದೆ.LLP ಗಳನ್ನು CLARIOstar ಪ್ಲೇಟ್ ರೀಡರ್‌ನಲ್ಲಿ (BMG ಲ್ಯಾಬ್‌ಟೆಕ್, ಒರ್ಟೆನ್‌ಬರ್ಗ್, ಜರ್ಮನಿ) ದ್ರಾವಣದ ಮಧ್ಯದಲ್ಲಿ 350 nm ನಲ್ಲಿ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವಿಕೆಯನ್ನು ಅಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡಲಾಯಿತು.ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು 25 ° C ನಲ್ಲಿ ಮೂರು ಬಾರಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ಮತ್ತು ದೋಷಗಳನ್ನು ಸರಾಸರಿಯಿಂದ ಪ್ರಮಾಣಿತ ವಿಚಲನ ಎಂದು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.ಸ್ಯಾಂಪಲ್ ಸೆಂಟ್ರಿಫ್ಯೂಗೇಶನ್ ಮತ್ತು SDS-PAGE ಜೆಲ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ದುರ್ಬಲ ಹಂತವನ್ನು ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಿದ ಮತ್ತು ಕೇಂದ್ರೀಕೃತ ಹಂತಗಳಲ್ಲಿನ αS ಭಾಗವು ವಿವಿಧ LLPS ಪರಿಹಾರಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಿಸಲ್ಪಟ್ಟಿದೆ.1 μM AF488-ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ αS ಅನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿರುವ 100 μl LLPS ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣ ಮಿಶ್ರಣದ ಮೂಲಕ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 9600×g ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ ತಯಾರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ನಂತರ ಅವಕ್ಷೇಪವು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಗೋಚರಿಸುತ್ತದೆ.SDS-PAGE ಜೆಲ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಪ್ರೋಟೀನ್ ಪ್ರಮಾಣೀಕರಣಕ್ಕಾಗಿ ಸೂಪರ್‌ನಾಟಂಟ್‌ನ ಅಗ್ರ 50 μl ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಯಿತು.ಜೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ಕೆಮಿಡಾಕ್ ಜೆಲ್ ಇಮೇಜಿಂಗ್ ಸಿಸ್ಟಮ್ (ಬಯೋ-ರಾಡ್ ಲ್ಯಾಬೊರೇಟರೀಸ್, ಹರ್ಕ್ಯುಲಸ್, ಸಿಎ, ಯುಎಸ್‌ಎ) ಬಳಸಿಕೊಂಡು AF488 ಫಿಲ್ಟರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಸ್ಕ್ಯಾನ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಅಥವಾ ಕೂಮಾಸ್ಸಿ ಸ್ಟೇನ್‌ನಿಂದ ಬಣ್ಣಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಸೂಕ್ತವಾದ ಫಿಲ್ಟರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳನ್ನು ಇಮೇಜ್‌ಜೆ ಆವೃತ್ತಿ 1.53i (ನ್ಯಾಷನಲ್ ಇನ್‌ಸ್ಟಿಟ್ಯೂಟ್ ಆಫ್ ಹೆಲ್ತ್, ಯುಎಸ್‌ಎ) ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ.ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಎರಡು ವಿಭಿನ್ನ ಪ್ರಯೋಗಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಕಲಿನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ವಿಶಿಷ್ಟವಾಗಿ, 150 μl ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಬಂಧಿಸದ 96-ವೆಲ್ ಮೈಕ್ರೊಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಅನ್ವಯಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಲೈಕಾ DMI6000B ವಿಲೋಮ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದಲ್ಲಿ (ಲೈಕಾ ಮೈಕ್ರೋಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್, ವೆಟ್ಜ್ಲರ್, ಜರ್ಮನಿ) ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲಾಯಿತು.ಸ್ಪಾಟ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗಾಗಿ, µ-ಸ್ಲೈಡ್ ಆಂಜಿಯೋಜೆನೆಸಿಸ್ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳು (ಐಬಿಡಿ ಜಿಎಂಬಿಹೆಚ್, ಗ್ರಾಫೆಲ್ಫಿಂಗ್, ಜರ್ಮನಿ) ಅಥವಾ 96-ವೆಲ್ ಪಾಲಿಸ್ಟೈರೀನ್ ಮೈಕ್ರೊಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು (ಕಾರ್ನಿಂಗ್ ಕೋಸ್ಟಾರ್ ಕಾರ್ಪೊರೇಷನ್, ಆಕ್ಟನ್, ಮ್ಯಾಸಚೂಸೆಟ್ಸ್) ಸಹ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.EL6000 ಹ್ಯಾಲೊಜೆನ್ ಅಥವಾ ಪಾದರಸ ಲೋಹದ ಹಾಲೈಡ್ ದೀಪಗಳನ್ನು ಪ್ರಕಾಶದ ಮೂಲಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ (ಕ್ರಮವಾಗಿ BF/DIC ಮತ್ತು WF ಚಿತ್ರಣಕ್ಕಾಗಿ).WF ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಗಾಗಿ, ಮಾದರಿಯ ಮೇಲೆ ಬೆಳಕನ್ನು ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಲು ಮತ್ತು ಅದನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸಲು 40x ಮ್ಯಾಗ್ನಿಫಿಕೇಶನ್ ಏರ್ ಉದ್ದೇಶವನ್ನು (ಲೈಕಾ ಮೈಕ್ರೋಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್, ಜರ್ಮನಿ) ಬಳಸಲಾಯಿತು.AF488 ಮತ್ತು ThT ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ, ಪ್ರಮಾಣಿತ GFP ಫಿಲ್ಟರ್ ಸೆಟ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಫಿಲ್ಟರ್ ಪ್ರಚೋದನೆ ಮತ್ತು ಹೊರಸೂಸುವಿಕೆ, ಪ್ರಚೋದನೆ ಮತ್ತು ಹೊರಸೂಸುವಿಕೆ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಪಾಸ್ ಫಿಲ್ಟರ್‌ಗಳು, ಕ್ರಮವಾಗಿ, 460–500 nm ಮತ್ತು 512–542 nm ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಪಾಸ್ ಫಿಲ್ಟರ್‌ಗಳು ಮತ್ತು 495 nm ಡೈಕ್ರೊಯಿಕ್ ಮಿರರ್.Atto647N ನೊಂದಿಗೆ ಲೇಬಲ್ ಮಾಡಲಾದ ಮಾದರಿಗಳಿಗಾಗಿ, ಪ್ರಚೋದನೆ ಮತ್ತು ಹೊರಸೂಸುವಿಕೆ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಪಾಸ್ ಫಿಲ್ಟರ್‌ಗಳು ಕ್ರಮವಾಗಿ 628-40 nm ಮತ್ತು 692-40 nm ಹೊಂದಿರುವ Cy5 ಫಿಲ್ಟರ್‌ಗಳ ಪ್ರಮಾಣಿತ ಸೆಟ್ ಮತ್ತು 660 nm ಡೈಕ್ರೊಯಿಕ್ ಮಿರರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.BF ಮತ್ತು DIC ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿಗಾಗಿ, ಅದೇ ಪ್ರತಿಫಲಿತ ಬೆಳಕಿನ ಸಂಗ್ರಹಣೆಯ ಉದ್ದೇಶವನ್ನು ಬಳಸಿ.ಸಂಗ್ರಹಿಸಿದ ಬೆಳಕನ್ನು ಲೈಕಾ DFC7000 CCD ಕ್ಯಾಮೆರಾದಲ್ಲಿ ದಾಖಲಿಸಲಾಗಿದೆ (ಲೈಕಾ ಮೈಕ್ರೋಸಿಸ್ಟಮ್ಸ್, ಜರ್ಮನಿ).BF ಮತ್ತು DIC ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ಇಮೇಜಿಂಗ್‌ಗೆ 50 ms ಮತ್ತು WF ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ಇಮೇಜಿಂಗ್‌ಗೆ 20-100 ms ಮಾನ್ಯತೆ ಸಮಯ.ಹೋಲಿಕೆಗಾಗಿ, ThT ಯೊಂದಿಗಿನ ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ ಮಾನ್ಯತೆ ಸಮಯವು 100 ms ಆಗಿತ್ತು.ಹಲವಾರು ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಪ್ರತಿ 100 ಎಂಎಸ್‌ಗೆ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಸಂಗ್ರಹಿಸುವುದರೊಂದಿಗೆ, ಹನಿಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯನ್ನು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲು ಟೈಮ್-ಲ್ಯಾಪ್ಸ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಇಮೇಜ್ ಜೆ (NIH, USA) ಅನ್ನು ಚಿತ್ರ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಮೂರು ಬಾರಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಕೊಲೊಕಲೈಸೇಶನ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗಾಗಿ, FRAP ಮತ್ತು 3D ಪುನರ್ನಿರ್ಮಾಣಕ್ಕಾಗಿ, ZEN 2 ನೀಲಿ ಆವೃತ್ತಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು Zeiss LSM 880 ತಲೆಕೆಳಗಾದ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್‌ನಲ್ಲಿ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಪಡೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ (ಕಾರ್ಲ್ ಝೈಸ್ AG, ಒಬರ್ಕೊಚೆನ್, ಜರ್ಮನಿ).50 µl ನ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು µ-ಸ್ಲೈಡ್ ಆಂಜಿಯೋಜೆನೆಸಿಸ್ ಪೆಟ್ರಿ ಭಕ್ಷ್ಯಗಳಿಗೆ (ಐಬಿಡಿ ಜಿಎಂಬಿಹೆಚ್, ಗ್ರೋಫೆಲ್ಫಿಂಗ್, ಜರ್ಮನಿ) ಅನ್ವಯಿಸಲಾಗಿದೆ, ಹೈಡ್ರೋಫಿಲಿಕ್ ಪಾಲಿಮರ್ (ಐಬಿಟ್ರೀಟ್) ನೊಂದಿಗೆ ಚಿಕಿತ್ಸೆ ನೀಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 63× ತೈಲ ಇಮ್ಮರ್ಶನ್ ಉದ್ದೇಶ (ಪ್ಲಾನ್-ಅಪೋಕ್ರೊಮ್ಯಾಟ್ 63/ಇಲ್ NA) ನಲ್ಲಿ ಅಳವಡಿಸಲಾಗಿದೆ. DIC ನಲ್ಲಿ).458 nm, 488 nm, ಮತ್ತು 633 nm ಆರ್ಗಾನ್ ಲೇಸರ್ ಲೈನ್‌ಗಳನ್ನು 0.26 µm/ಪಿಕ್ಸೆಲ್‌ನ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಮತ್ತು 8 µs/ಪಿಕ್ಸೆಲ್‌ನ ಎಕ್ಸ್‌ಪೋಸರ್ ಸಮಯದೊಂದಿಗೆ 470–600 nm, 840 nm, 62 600 nm ನ ಪ್ರಚೋದನೆ ಮತ್ತು ಹೊರಸೂಸುವಿಕೆ ಪತ್ತೆ ವಿಂಡೋಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಪಡೆದುಕೊಳ್ಳಲಾಗಿದೆ. ಮತ್ತು 638–755 nm ಅನ್ನು ಕ್ರಮವಾಗಿ ThT, AF488 ಮತ್ತು Atto647N ಅನ್ನು ದೃಶ್ಯೀಕರಿಸಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು.FRAP ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗಾಗಿ, ಪ್ರತಿ ಮಾದರಿಯ ಸಮಯ-ನಷ್ಟದ ಛಾಯಾಗ್ರಹಣವನ್ನು ಪ್ರತಿ ಸೆಕೆಂಡಿಗೆ 1 ಫ್ರೇಮ್‌ನಲ್ಲಿ ದಾಖಲಿಸಲಾಗಿದೆ.ಇದೇ ರೀತಿಯ ಫಲಿತಾಂಶಗಳೊಂದಿಗೆ ಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಮೂರು ಬಾರಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಎಲ್ಲಾ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಝೆನ್ 2 ನೀಲಿ ಆವೃತ್ತಿಯ ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ ಬಳಸಿ ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ (ಕಾರ್ಲ್ ಝೈಸ್ ಎಜಿ, ಒಬರ್ಕೊಚೆನ್, ಜರ್ಮನಿ).FRAP ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ, ಪ್ಲಾಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು OriginPro 9.1 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು Zen 2 ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಚಿತ್ರಗಳಿಂದ ಹೊರತೆಗೆಯಲಾದ ತೀವ್ರತೆ/ಸಮಯದ ಡೇಟಾಗೆ ಅಳವಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ಸ್ವಾಧೀನ ಬ್ಲೀಚಿಂಗ್ ಪರಿಣಾಮವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲು ಹೆಚ್ಚುವರಿ ಘಾತೀಯ ಪದದೊಂದಿಗೆ ಆಣ್ವಿಕ ಪ್ರಸರಣವನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲು ಮರುಪಡೆಯುವಿಕೆ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳನ್ನು ಮೊನೊ-ಘಾತೀಯ ಮಾದರಿಗೆ ಅಳವಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ನಾವು ನಂತರ ನಾಮಮಾತ್ರದ ಬ್ಲೀಚಿಂಗ್ ತ್ರಿಜ್ಯವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು D ಅನ್ನು ಲೆಕ್ಕಾಚಾರ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ ಮತ್ತು Kang et al ನ ಸಮೀಕರಣದಂತೆ ಹಿಂದೆ ನಿರ್ಧರಿಸಿದ ಚೇತರಿಕೆಯ ಅರ್ಧ-ಜೀವಿತಾವಧಿ.5 35 ತೋರಿಸಲಾಗಿದೆ.
24 (TEMPOL-24-αS) ಮತ್ತು 122 (TEMPOL-122-αS) ಸ್ಥಾನಗಳಲ್ಲಿ 4-ಹೈಡ್ರಾಕ್ಸಿ-2,2,6,6-ಟೆಟ್ರಾಮೆಥೈಲ್ಪಿಪೆರಿಡಿನ್-ಎನ್-ಆಕ್ಸಿಲ್ (TEMPOL) ನೊಂದಿಗೆ αS ನ ಏಕ ಸಿಸ್ಟೀನ್ ರೂಪಾಂತರಗಳನ್ನು ಸಂಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ, ಕ್ರಮವಾಗಿ.ಸ್ಪಿನ್ ಲೇಬಲಿಂಗ್ EPR ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗಾಗಿ, αS ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು 100 μM ನಲ್ಲಿ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು PEG ಸಾಂದ್ರತೆಯು 15% (w/v) ಆಗಿತ್ತು.ವಿವಿಧ ಒಟ್ಟುಗೂಡಿಸುವಿಕೆಯ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಿಗಾಗಿ, αS:pLK ಅನುಪಾತವು 1:10 ಆಗಿದ್ದರೆ, αS:ΔNt-Tau ಮತ್ತು αS:Tau441 ಅನುಪಾತಗಳನ್ನು 1:1 ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಗಿದೆ.ಜನಸಂದಣಿಯ ಅನುಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಟೈಟರೇಶನ್ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗಾಗಿ, TEMPOL-122-αS ಅನ್ನು 50 μM ನಲ್ಲಿ ನಿರ್ವಹಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಹೆಚ್ಚುತ್ತಿರುವ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿ ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳನ್ನು ಟೈಟ್ರೇಟ್ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ, ಪ್ರತಿ ಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾಗಿ ಸಿದ್ಧಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ.CW-EPR ಮಾಪನಗಳನ್ನು ಬ್ರೂಕರ್ ELEXSYS E580 X-ಬ್ಯಾಂಡ್ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ ಬಳಸಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು, ಬ್ರೂಕರ್ ER4118 SPT-N1 ರೆಸೋನೇಟರ್ ~9.7 GHz ನ ಮೈಕ್ರೋವೇವ್ (SHF) ಆವರ್ತನದಲ್ಲಿ ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುತ್ತದೆ.ತಾಪಮಾನವನ್ನು 25 ° C ನಲ್ಲಿ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ದ್ರವರೂಪದ ಸಾರಜನಕ ಕ್ರಯೋಸ್ಟಾಟ್‌ನಿಂದ ನಿಯಂತ್ರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ.4 mW ನ MW ಶಕ್ತಿ, 0.1 mT ನ ಮಾಡ್ಯುಲೇಶನ್ ವೈಶಾಲ್ಯ ಮತ್ತು 100 kHz ನ ಮಾಡ್ಯುಲೇಶನ್ ಆವರ್ತನದಲ್ಲಿ ಅಪರ್ಯಾಪ್ತ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳಲ್ಲಿ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.Tau441 ಅಥವಾ ΔNt-Tau (ಮೂಲ ಪ್ರೊಟೀನ್ ದ್ರಾವಣಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರಸ್ತುತ) ಹೊಂದಿರುವ ಮಾದರಿಗಳಲ್ಲಿ ಏಜೆಂಟ್‌ಗಳನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುವ ಉಳಿದ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಿಂದಾಗಿ ಮಾದರಿಗಳ ನಡುವಿನ ಸ್ಪಿನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿನ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳು ಮತ್ತು ಸಂಭವನೀಯ ಸ್ಪಿನ್ ಕಡಿತವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸಲು ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಲ್ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯಗೊಳಿಸಲಾಗಿದೆ.Matlab®67 ನಲ್ಲಿ ಅಳವಡಿಸಲಾಗಿರುವ Easyspin ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (v. 6.0.0-dev.34) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ನಿರ್ವಹಿಸಲಾದ EPR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಲ್ ಮಾಡೆಲಿಂಗ್‌ನ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ g ನ ನೀಡಲಾದ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.ಒಂದು/ಎರಡು ಘಟಕ ಐಸೊಟ್ರೊಪಿಕ್ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಡೇಟಾವನ್ನು ಮಾದರಿ ಮಾಡಲು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಎಲ್ಲಾ ಸಂಕೇತಗಳನ್ನು ಸಾಮಾನ್ಯಗೊಳಿಸಿದ ನಂತರ, ಅನುಗುಣವಾದ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್‌ನಿಂದ ಪ್ರತಿ ಸಿಮ್ಯುಲೇಶನ್ ಅನ್ನು ಕಳೆಯುವ ಮೂಲಕ ಉಳಿಕೆಗಳನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಟೈಟರೇಶನ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, ಸಾಮಾನ್ಯೀಕರಿಸಿದ EPR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಮ್‌ನ (IIII/III) ಎರಡನೇ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗೆ ಮೂರನೇ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ನ ಸಾಪೇಕ್ಷ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು αS ಗೆ ಪಾಲಿಕೇಶನ್‌ಗಳ ಬಂಧಿಸುವಿಕೆಯನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡಲು ಬಳಸಲಾಯಿತು.ವಿಘಟನೆಯ ಸ್ಥಿರಾಂಕವನ್ನು (Kd) ಅಂದಾಜು ಮಾಡಲು, ಫಲಿತಾಂಶದ ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು n ಒಂದೇ ಮತ್ತು ಸ್ವತಂತ್ರ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಸೈಟ್‌ಗಳನ್ನು ಊಹಿಸುವ ಅಂದಾಜು ಮಾದರಿಗೆ ಅಳವಡಿಸಲಾಗಿದೆ.
NMR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ಬ್ರೂಕರ್ ನಿಯೋ 800 MHz (1H) NMR ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರೋಮೀಟರ್ ಬಳಸಿ ಕ್ರಯೋಪ್ರೋಬ್ ಮತ್ತು Z-ಗ್ರೇಡಿಯಂಟ್ ಅನ್ನು ಅಳವಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ಎಲ್ಲಾ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು 130-207 µM αS ಮತ್ತು 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 ನಲ್ಲಿ ಅನುಗುಣವಾದ αS/ΔNt-Tau ಮತ್ತು pLK ಸಮಾನತೆಗಳನ್ನು ಬಳಸಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು 15 °C ನಲ್ಲಿ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.NMR ಮೂಲಕ LPS ಅನ್ನು ಮೇಲ್ವಿಚಾರಣೆ ಮಾಡಲು, 10% PEG ಅನ್ನು ಪೂರ್ವ-ಮಿಶ್ರಿತ ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಗಿದೆ.ರಾಸಾಯನಿಕ ಶಿಫ್ಟ್ ಪರ್ಟರ್ಬೇಷನ್ ಪ್ಲಾಟ್ (Fig. 1b) ಸರಾಸರಿ 1H ಮತ್ತು 15N ರಾಸಾಯನಿಕ ಪಲ್ಲಟಗಳನ್ನು ತೋರಿಸುತ್ತದೆ.αS 2D1H-15N HSQC ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವನ್ನು ಹಿಂದಿನ ನಿಯೋಜನೆಯ ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ನಿಯೋಜಿಸಲಾಗಿದೆ (BMRB ಪ್ರವೇಶ #25227) ಮತ್ತು HNCA, HNCO ಮತ್ತು CBCAcoNH ನ 3D ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಾವನ್ನು ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸುವ ಮೂಲಕ ದೃಢೀಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.13Cα ಮತ್ತು 13Cβ ರಾಸಾಯನಿಕ ಪಲ್ಲಟಗಳನ್ನು ΔNt-Tau ಅಥವಾ pLK ಉಪಸ್ಥಿತಿಯಲ್ಲಿ αS ರಾಸಾಯನಿಕ ಪಲ್ಲಟಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ದ್ವಿತೀಯ ರಚನೆಯ ಪ್ರವೃತ್ತಿಯಲ್ಲಿ ಸಂಭವನೀಯ ಬದಲಾವಣೆಗಳನ್ನು ಅಳೆಯಲು 68 (ಅನುಬಂಧ ಚಿತ್ರ 5c) ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ.8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, ಮತ್ತು 800 ms ವಿಳಂಬಗಳೊಂದಿಗೆ hsqctretf3gpsi ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು (ಬ್ರೂಕರ್ ಲೈಬ್ರರಿಯಿಂದ ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ) ರೆಕಾರ್ಡಿಂಗ್ ಮಾಡುವ ಮೂಲಕ R1ρ ದರಗಳನ್ನು ಅಳೆಯಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಘಾತೀಯ ಕಾರ್ಯಗಳನ್ನು ವಿವಿಧ ವಿಳಂಬಗಳ ಗರಿಷ್ಠ ಮಟ್ಟಕ್ಕೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ. R1ρ ಮತ್ತು ಅದರ ಪ್ರಾಯೋಗಿಕ ಅನಿಶ್ಚಿತತೆಯನ್ನು ನಿರ್ಧರಿಸಲು ಸಮಯ.
ಸಮಯ-ಸಂಬಂಧಿತ ಏಕ ಫೋಟಾನ್ ಎಣಿಕೆ (TCSPC) ಸಾಧನದೊಂದಿಗೆ ವಾಣಿಜ್ಯ ಸಮಯ-ಪರಿಹರಿಸಿದ MT200 ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್ (PicoQuant, Berlin, Germany) ನಲ್ಲಿ ಎರಡು-ಬಣ್ಣದ ಸಮಯ-ಪರಿಹರಿಸಿದ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕ ಪ್ರಯೋಗಗಳನ್ನು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಲೇಸರ್ ಡಯೋಡ್ ಹೆಡ್ ಅನ್ನು ಪಲ್ಸೆಡ್ ಇಂಟರ್‌ಲೀವ್ ಎಕ್ಸೈಟೇಶನ್ (PIE) ಗಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ, ಕಿರಣವು ಸಿಂಗಲ್ ಮೋಡ್ ವೇವ್‌ಗೈಡ್ ಮೂಲಕ ಹಾದುಹೋಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 481 nm ಮತ್ತು 637 nm ಲೇಸರ್ ಲೈನ್‌ಗಳಿಗೆ 10 ರಿಂದ 100 nW ವರೆಗಿನ ಲೇಸರ್ ಪವರ್‌ಗೆ ಟ್ಯೂನ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಇದು ಅತ್ಯುತ್ತಮವಾದ ಫೋಟಾನ್ ಎಣಿಕೆಯ ದರವನ್ನು ಖಾತ್ರಿಗೊಳಿಸುತ್ತದೆ, ಫೋಟಾನ್ ಅಲಿಯಾಸಿಂಗ್, ಫೋಟೊಬ್ಲೀಚಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧತ್ವದ ಪರಿಣಾಮಗಳನ್ನು ತಪ್ಪಿಸುತ್ತದೆ.μ-ಸ್ಲೈಡ್ ಆಂಜಿಯೋಜೆನೆಸಿಸ್ ಕವರ್‌ಸ್ಲಿಪ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು (ಐಬಿಡಿ ಜಿಎಂಬಿಹೆಚ್, ಗ್ರಾಫೆಲ್ಫಿಂಗ್, ಜರ್ಮನಿ) ನೇರವಾಗಿ ಇಮ್ಮರ್ಶನ್ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಸೂಪರ್ ಅಪೋಕ್ರೊಮ್ಯಾಟ್ 60x NA 1.2 ಲೆನ್ಸ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಸರಿಪಡಿಸುವ ಕಾಲರ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಇರಿಸಲಾಗಿದೆ (ಒಲಿಂಪಸ್ ಲೈಫ್ ಸೈನ್ಸಸ್, ವಾಲ್ಥಮ್, USA).488/640 nm ಡೈಕ್ರೊಯಿಕ್ ಮಿರರ್ (ಸೆಮ್ರಾಕ್, ಲೇಕ್ ಫಾರೆಸ್ಟ್, IL, USA) ಅನ್ನು ಮುಖ್ಯ ಕಿರಣದ ಸ್ಪ್ಲಿಟರ್ ಆಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸದ ವಿಕಿರಣವನ್ನು 50 ಮೈಕ್ರಾನ್‌ಗಳ ವ್ಯಾಸದ ರಂಧ್ರದಿಂದ ನಿರ್ಬಂಧಿಸಲಾಗಿದೆ, ನಂತರ ಕೇಂದ್ರೀಕೃತ ವಿಕಿರಣವನ್ನು 50/50 ಕಿರಣದ ಸ್ಪ್ಲಿಟರ್‌ನಿಂದ 2 ಪತ್ತೆ ಮಾರ್ಗಗಳಾಗಿ ವಿಂಗಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಪಾಸ್ ಎಮಿಷನ್ ಫಿಲ್ಟರ್‌ಗಳು (ಸೆಮ್ರಾಕ್, ಲೇಕ್ ಫಾರೆಸ್ಟ್, IL, USA) 520/35 ಹಸಿರು ಬಣ್ಣಕ್ಕಾಗಿ (AF488) ಮತ್ತು 690/70 ಕೆಂಪು ಬಣ್ಣಕ್ಕಾಗಿ (Atto647N) ಡಿಟೆಕ್ಟರ್‌ನ ಮುಂದೆ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಏಕ-ಫೋಟಾನ್ ಅವಲಾಂಚ್ ಡಯೋಡ್‌ಗಳನ್ನು (SPAD) (ಮೈಕ್ರೋ ಫೋಟಾನ್ ಸಾಧನಗಳು, ಬೊಲ್ಜಾನೊ, ಇಟಲಿ) ಪತ್ತೆಕಾರಕಗಳಾಗಿ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ವಾಣಿಜ್ಯಿಕವಾಗಿ ಲಭ್ಯವಿರುವ SymfoTime64 ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (PicoQuant GmbH, ಬರ್ಲಿನ್, ಜರ್ಮನಿ) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಡೇಟಾ ಸಂಗ್ರಹಣೆ ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಎರಡನ್ನೂ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಎಲ್‌ಎಲ್‌ಪಿಎಸ್ ಮಾದರಿಗಳ ಐವತ್ತು ಮೈಕ್ರೋಲೀಟರ್‌ಗಳನ್ನು μ-ಸ್ಲೈಡ್ ಆಂಜಿಯೋಜೆನೆಸಿಸ್ ಬಾವಿಗಳಿಗೆ ಅನ್ವಯಿಸಲಾಗಿದೆ (ಐಬಿಡಿ ಜಿಎಂಬಿಹೆಚ್, ಗ್ರಾಫೆಲ್ಫಿಂಗ್, ಜರ್ಮನಿ).ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಅಮಾನತುಗೊಳಿಸಿದ ಹನಿಗಳಿಗೆ ಸೂಕ್ತ ವಸ್ತುನಿಷ್ಠ ಕೆಲಸದ ಅಂತರಕ್ಕಾಗಿ ಬಾವಿ ತಳದಿಂದ 20 µm ವರೆಗೆ ಮತ್ತು ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಚುಕ್ಕೆಗಳಿಗೆ ~1 µm ವರೆಗೆ ಕೇಂದ್ರೀಕರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕನಿಷ್ಠ 0.25 µm/ಪಿಕ್ಸೆಲ್‌ನ ಅಕ್ಷೀಯ ರೆಸಲ್ಯೂಶನ್ ಮತ್ತು 400 µs/ಪಿಕ್ಸೆಲ್‌ನ ವಿಳಂಬ ಸಮಯ.ಪ್ರತಿ ಚಾನಲ್‌ಗೆ ಸರಾಸರಿ ಹಿನ್ನೆಲೆ ಸಿಗ್ನಲ್ ತೀವ್ರತೆಯ (PBG, ಸರಾಸರಿ + 2σ) ಆಧಾರದ ಮೇಲೆ ತೀವ್ರತೆಯ ಮಿತಿಯನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸುವ ಮೂಲಕ ಡೇಟಾವನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿ ಇದರಿಂದ ದ್ರವ ಪ್ರೋಟೀನ್ ಹನಿಗಳು, ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಕಲೆಗಳನ್ನು ಮಾತ್ರ ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ, ಚದುರಿದ ಹಂತದಿಂದ ಯಾವುದೇ ಸಂಭವನೀಯ ಮೂಲವನ್ನು ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ಪ್ರತಿ ಚಾನಲ್‌ನ ಪ್ರತಿ ಜಾತಿಯ (τ) ಜೀವಿತಾವಧಿಯನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು (AF488 ಗಾಗಿ ಹಸಿರು, “g” ಮತ್ತು ಕೆಂಪು, Atto647N ಗಾಗಿ “r”), ನಾವು ಹನಿಗಳು, ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ತಾಣಗಳನ್ನು ಹೊಂದಿರುವ ಆಸಕ್ತಿಯ ಪ್ರದೇಶಗಳನ್ನು (ROI ಗಳು) ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಿದ್ದೇವೆ (ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 1 )8b) ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಚಾನಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಬಾಲ-ಫಿಟ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಎರಡು-ಘಟಕ ಕೊಳೆತ ಮಾದರಿಯನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅವುಗಳ ಜೀವಿತಾವಧಿಯ ಕೊಳೆತವನ್ನು (ಹನಿಗಳು, ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ತಾಣಗಳಿಗೆ ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿ τD, τR ಮತ್ತು τP, ಪೂರಕ ಚಿತ್ರ 8c ನೋಡಿ) ಅಳವಡಿಸುವ ಮೂಲಕ ಅವುಗಳನ್ನು ಪಡೆಯಲಾಗಿದೆ.τ ನಿಂದ ಸರಾಸರಿ τ .ಬಹು-ಘಾತೀಯ ಫಿಟ್‌ಗಾಗಿ ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆ ಫೋಟಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುವ ROI ಗಳನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಹೊರಗಿಡಲಾಗಿದೆ.ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಡಾಟ್‌ಗಳಿಗೆ <104 ಫೋಟಾನ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಡ್ರಾಪ್‌ಗಳಿಗೆ 103 ಕಟ್‌ಆಫ್ ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಹನಿಗಳು ಕಡಿಮೆ ಮಿತಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುತ್ತವೆ ಏಕೆಂದರೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ತೀವ್ರತೆಯ ಮೌಲ್ಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಕೊಳೆಯುವ ವಕ್ರಾಕೃತಿಗಳನ್ನು ಪಡೆಯುವುದು ಕಷ್ಟ, ಏಕೆಂದರೆ ಚಿತ್ರ ಕ್ಷೇತ್ರದಲ್ಲಿನ ಹನಿಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿರುತ್ತವೆ ಮತ್ತು ಕಡಿಮೆ ಸಂಖ್ಯೆಯಲ್ಲಿರುತ್ತವೆ.ಫೋಟಾನ್ ಸಂಚಯನ ಮಿತಿಗಿಂತ (> 500 ಎಣಿಕೆಗಳು/ಪಿಕ್ಸೆಲ್‌ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ) ಫೋಟಾನ್ ಎಣಿಕೆಗಳೊಂದಿಗೆ ROI ಗಳನ್ನು ಸಹ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ತಿರಸ್ಕರಿಸಲಾಗಿದೆ.ಆಸಕ್ತಿಯ ಪ್ರದೇಶದಿಂದ ಪಡೆದ ತೀವ್ರತೆಯ ಕೊಳೆತ ಕರ್ವ್ ಅನ್ನು ಸೇವಾ ಜೀವನದ ಪ್ರಾರಂಭದಿಂದ ಗರಿಷ್ಠ 90% (ಕೊಳೆಯುವಿಕೆಯ ಗರಿಷ್ಠ ತೀವ್ರತೆಯ ನಂತರ ಸ್ವಲ್ಪ) ತೀವ್ರತೆಯೊಂದಿಗೆ ಹೊಂದಿಸಿ, ಎಲ್ಲಾ ತೀವ್ರತೆಯ ಕೊಳೆಯುವಿಕೆಗೆ ಅದೇ ರೀತಿ ನಿರ್ವಹಿಸುವಾಗ ಕನಿಷ್ಠ IRF ಹಸ್ತಕ್ಷೇಪವನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಸೆಟ್ಟಿಂಗ್‌ಗಳು ಸಾಪೇಕ್ಷ ಸಮಯ ವಿಂಡೋ ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಸ್ಪಾಟ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ 25 ರಿಂದ 50 ROI ಮತ್ತು ಡ್ರಾಪ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ 15-25 ROI ಅನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲಾಗಿದೆ, ಕನಿಷ್ಠ 3 ಸ್ವತಂತ್ರ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಂದ ರೆಕಾರ್ಡ್ ಮಾಡಲಾದ 4 ಕ್ಕಿಂತ ಹೆಚ್ಚು ಪ್ರತಿಕೃತಿಗಳಿಂದ ಚಿತ್ರಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆ ಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ಎರಡು-ಬಾಲದ ಟಿ-ಪರೀಕ್ಷೆಗಳನ್ನು ಜಾತಿಗಳ ನಡುವೆ ಅಥವಾ ಕೋಸರ್ವೇಟ್ ವ್ಯವಸ್ಥೆಗಳ ನಡುವಿನ ಅಂಕಿಅಂಶಗಳ ವ್ಯತ್ಯಾಸಗಳನ್ನು ಮೌಲ್ಯಮಾಪನ ಮಾಡಲು ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಜೀವಿತಾವಧಿಯ (τ) ಪಿಕ್ಸೆಲ್-ಬೈ-ಪಿಕ್ಸೆಲ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, ಪ್ರತಿ ಚಾನಲ್‌ಗೆ ಕ್ಷೇತ್ರದ ಮೇಲೆ ಜೀವಿತಾವಧಿಯ ಒಟ್ಟು ಅಟೆನ್ಯೂಯೇಶನ್ ಅನ್ನು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು 2/3-ಘಟಕ ಘಾತೀಯ ಅಟೆನ್ಯೂಯೇಶನ್ ಮಾದರಿಯ ಅಂದಾಜು ನಡೆಸಲಾಯಿತು.ಪ್ರತಿ ಪಿಕ್ಸೆಲ್‌ಗೆ ಜೀವಿತಾವಧಿಯ ಅಟೆನ್ಯೂಯೇಶನ್ ಅನ್ನು ಹಿಂದೆ ಲೆಕ್ಕ ಹಾಕಿದ τ ಮೌಲ್ಯಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಅಳವಡಿಸಲಾಯಿತು, ಇದರ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಒಂದು ಸೂಡೊಕಲರ್ FLIM ಫಿಟ್ ಇಮೇಜ್ ದೊರೆಯುತ್ತದೆ.ಟೈಲ್-ಫಿಟ್ ಜೀವಿತಾವಧಿಯ ವ್ಯಾಪ್ತಿಯು ಒಂದೇ ಚಾನಲ್‌ನ ಎಲ್ಲಾ ಚಿತ್ರಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದೇ ಆಗಿರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪ್ರತಿ ಕೊಳೆತವು ವಿಶ್ವಾಸಾರ್ಹ ಫಿಟ್ ಅನ್ನು ಒದಗಿಸಲು ಸಾಕಷ್ಟು ಫೋಟಾನ್‌ಗಳನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸುತ್ತದೆ.FRET ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, 100 ಫೋಟಾನ್‌ಗಳ ಕಡಿಮೆ ತೀವ್ರತೆಯ ಮಿತಿಯನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸುವ ಮೂಲಕ ಪಿಕ್ಸೆಲ್‌ಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡಲಾಗಿದೆ, ಇದು ಸರಾಸರಿ 11 ಫೋಟಾನ್‌ಗಳ ಹಿನ್ನೆಲೆ ಸಂಕೇತವನ್ನು (FBG) ಹೊಂದಿದೆ.ಪ್ರತಿ ಚಾನಲ್‌ನ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ಪ್ರಾಯೋಗಿಕವಾಗಿ ನಿರ್ಧರಿಸಿದ ತಿದ್ದುಪಡಿ ಅಂಶಗಳಿಂದ ಸರಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ: 69 ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಲ್ ಕ್ರಾಸ್‌ಸ್ಟಾಕ್ α 0.004, ನೇರ ಪ್ರಚೋದನೆ β 0.0305, ಪತ್ತೆ ದಕ್ಷತೆ γ 0.517.ಪಿಕ್ಸೆಲ್ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ FRET ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ನಂತರ ಕೆಳಗಿನ ಸಮೀಕರಣವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ:
ಎಫ್‌ಡಿಡಿ ಎಂಬುದು ದಾನಿ (ಹಸಿರು) ಚಾನಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತೀವ್ರತೆಯಾಗಿದೆ, ಎಫ್‌ಡಿಎ ಪರೋಕ್ಷ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಸ್ವೀಕರಿಸುವ (ಕೆಂಪು) ಚಾನಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತೀವ್ರತೆಯಾಗಿದೆ ಮತ್ತು ಎಫ್‌ಎಎ ನೇರ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಅಡಿಯಲ್ಲಿ ಸ್ವೀಕರಿಸುವ (ಕೆಂಪು) ಚಾನಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಕಂಡುಬರುವ ಪ್ರತಿದೀಪಕ ತೀವ್ರತೆಯಾಗಿದೆ ( PIE).ಚಾನಲ್‌ನಲ್ಲಿ ಫ್ಲೋರೊಸೆನ್ಸ್ ತೀವ್ರತೆಯ ಕಾಳುಗಳನ್ನು ಗಮನಿಸಲಾಗಿದೆ).
25 µM ಲೇಬಲ್ ಮಾಡದ ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ Tau441 (25 µM αS ನೊಂದಿಗೆ ಅಥವಾ ಇಲ್ಲದೆ) ಹೊಂದಿರುವ 100 µl LLPS ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಹಾರಗಳನ್ನು LLPS ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ (ಮೇಲಿನಂತೆ ಪೂರಕವಾಗಿದೆ) ಅಂಟಿಕೊಳ್ಳದ 96-ವೆಲ್ ಮೈಕ್ರೋಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳ ಮೇಲೆ ಅಂಟಿಕೊಳ್ಳುವ ಫಾಯಿಲ್ ಲೇಪನದೊಂದಿಗೆ ಇರಿಸಿ ಮತ್ತು WF ರಚನೆಯ ನಂತರ ಮೈಕ್ರೋಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಿ ಸಮೀಕರಣ.10 ನಿಮಿಷಗಳಲ್ಲಿಕೋಣೆಯ ಉಷ್ಣಾಂಶದಲ್ಲಿ 48 ಗಂಟೆಗಳ ಕಾವು ನಂತರ, ಪ್ರೋಟೀನ್ ರಾಫ್ಟ್ಗಳು ಮತ್ತು ಚುಕ್ಕೆಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು ದೃಢಪಡಿಸಲಾಯಿತು.ನಂತರ ಬಾವಿಗಳಿಂದ ರಾಫ್ಟ್‌ಗಳ ಮೇಲಿರುವ ದ್ರವವನ್ನು ಎಚ್ಚರಿಕೆಯಿಂದ ತೆಗೆದುಹಾಕಿ, ನಂತರ 50 ಎಲ್ ಡಿಸೋಸಿಯೇಶನ್ ಬಫರ್ (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ಸೇರಿಸಿ ಮತ್ತು 10 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕಾವುಕೊಡಿ.ಹೆಚ್ಚಿನ ಉಪ್ಪಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ಉಳಿದಿರುವ PEG ಯ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ LLPS ಪುನರಾವರ್ತನೆಯಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಎಂದು ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸ್ಥಾಯೀವಿದ್ಯುತ್ತಿನ ಸಂವಹನಗಳಿಂದ ಮಾತ್ರ ರೂಪುಗೊಂಡ ಸಂಭವನೀಯ ಪ್ರೊಟೀನ್ ಅಸೆಂಬ್ಲಿಗಳನ್ನು ಡಿಸ್ಅಸೆಂಬಲ್ ಮಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ.ನಂತರ ಬಾವಿಯ ಕೆಳಭಾಗವನ್ನು ಮೈಕ್ರೊಪಿಪೆಟ್ ತುದಿಯಿಂದ ಎಚ್ಚರಿಕೆಯಿಂದ ಒರೆಸಲಾಯಿತು ಮತ್ತು ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಪರಿಹಾರವನ್ನು ಖಾಲಿ ವೀಕ್ಷಣಾ ಬಾವಿಗೆ ವರ್ಗಾಯಿಸಲಾಯಿತು.1 ಗಂಟೆಗೆ 50 μM ThT ಯೊಂದಿಗೆ ಮಾದರಿಗಳ ಕಾವು ನಂತರ, ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ ತಾಣಗಳ ಉಪಸ್ಥಿತಿಯನ್ನು WF ಸೂಕ್ಷ್ಮದರ್ಶಕದಿಂದ ಪರಿಶೀಲಿಸಲಾಗಿದೆ.pH 7.4, ಸೋಡಿಯಂ ಅಜೈಡ್ 0.01% ನಲ್ಲಿ 37 °C ಮತ್ತು 200 rpm ನಲ್ಲಿ 7 ದಿನಗಳ ಕಾಲ PBS ನಲ್ಲಿ 70-µM αS ದ್ರಾವಣದ 300 µl ಅನ್ನು ಕಾವುಕೊಡುವ ಮೂಲಕ sonicated αS ಫೈಬ್ರಿಲ್‌ಗಳನ್ನು ತಯಾರಿಸಿ.ಪರಿಹಾರವನ್ನು ನಂತರ 30 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ 9600×g ನಲ್ಲಿ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿಗೊಳಿಸಲಾಯಿತು, ಪೆಲೆಟ್ ಅನ್ನು PBS pH 7.4 ನಲ್ಲಿ ಮರುಜೋಡಿಸಲಾಗಿದೆ ಮತ್ತು sonicated (1 ನಿಮಿಷ, 50% ಸೈಕಲ್, ವೈಬ್ರಾ-ಸೆಲ್ VC130 ಸೋನಿಕೇಟರ್‌ನಲ್ಲಿ 80% ವೈಶಾಲ್ಯ, ಸೋನಿಕ್ಸ್, ನ್ಯೂಟನ್, USA) ಫೈಬ್ರಿಲ್ ಮಾದರಿಗಳು ಸಣ್ಣ ಫೈಬ್ರಿಲ್ಗಳ ತುಲನಾತ್ಮಕವಾಗಿ ಏಕರೂಪದ ಗಾತ್ರದ ವಿತರಣೆಯೊಂದಿಗೆ.
FCS/FCCS ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಎರಡು-ಬಣ್ಣದ ಕಾಕತಾಳೀಯ ಪತ್ತೆ (TCCD) ಅನ್ನು ಅದೇ MT200 ಸಮಯ-ಪರಿಹರಿಸಿದ ಫ್ಲೋರೊಸೆಂಟ್ ಕಾನ್ಫೋಕಲ್ ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪ್‌ನಲ್ಲಿ (ಪಿಕೊ-ಕ್ವಾಂಟ್, ಬರ್ಲಿನ್, ಜರ್ಮನಿ) PIE ಮೋಡ್ ಅನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು FLIM-FRET ಮೈಕ್ರೋಸ್ಕೋಪಿ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ ಬಳಸಲಾಯಿತು.ಈ ಪ್ರಯೋಗಗಳಿಗೆ ಲೇಸರ್ ಶಕ್ತಿಯನ್ನು 6.0 µW (481 nm) ಮತ್ತು 6.2 µW (637 nm) ಗೆ ಸೇರಿಸಲಾಯಿತು.ಈ ಲೇಸರ್ ಶಕ್ತಿಗಳ ಸಂಯೋಜನೆಯು ಸೂಕ್ತವಾದ ಎಣಿಕೆ ದರಗಳನ್ನು ಸಾಧಿಸುವಾಗ ಮತ್ತು ಫೋಟೊಬ್ಲೀಚಿಂಗ್ ಮತ್ತು ಶುದ್ಧತ್ವವನ್ನು ತಪ್ಪಿಸುವಾಗ ಬಳಸಲಾಗುವ ಜೋಡಿ ಫ್ಲೋರೋಫೋರ್‌ಗಳಿಗೆ ಒಂದೇ ರೀತಿಯ ಹೊಳಪನ್ನು ಉತ್ಪಾದಿಸಲು ಆಯ್ಕೆಮಾಡಲಾಗಿದೆ.ವಾಣಿಜ್ಯಿಕವಾಗಿ ಲಭ್ಯವಿರುವ SymfoTime64 ಆವೃತ್ತಿ 2.3 ಸಾಫ್ಟ್‌ವೇರ್ (PicoQuant, Berlin, Germany) ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಡೇಟಾ ಸಂಗ್ರಹಣೆ ಮತ್ತು ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಎರಡನ್ನೂ ನಡೆಸಲಾಯಿತು.
ಎಲ್‌ಎಲ್‌ಪಿಎಸ್ ಬಳಸಿ ಪಡೆಯಲಾದ ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ αS/ಟೌ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಪ್ರತ್ಯೇಕ ಬಫರ್‌ನಲ್ಲಿ ಸೂಕ್ತವಾದ ಮೊನೊಮಾಲಿಕ್ಯುಲರ್ ಸಾಂದ್ರತೆಗೆ ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ (ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ 1:500 ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಿಕೆ, ಏಕೆಂದರೆ ಒಟ್ಟುಗಳು ಈಗಾಗಲೇ ಕೋಸರ್ವೇಟ್ ಮಾದರಿಗಳಿಂದ ಪ್ರತ್ಯೇಕಿಸಲ್ಪಟ್ಟಾಗ ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳಲ್ಲಿರುತ್ತವೆ).ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ಕವರ್‌ಸ್ಲಿಪ್‌ಗಳಿಗೆ (ಕಾರ್ನಿಂಗ್, USA) 1 mg/mL ಸಾಂದ್ರತೆಯಲ್ಲಿ BSA ದ್ರಾವಣದೊಂದಿಗೆ ಪೂರ್ವ ಲೇಪಿಸಲಾಯಿತು.
ಹಸಿರು ಮತ್ತು ಕೆಂಪು ಚಾನೆಲ್‌ಗಳಲ್ಲಿ PIE-smFRET ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, ಮಾನೋಮೆರಿಕ್ ಘಟನೆಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗುವ ಕಡಿಮೆ ತೀವ್ರತೆಯ ಸಂಕೇತಗಳನ್ನು ಫಿಲ್ಟರ್ ಮಾಡಲು 25 ಫೋಟಾನ್‌ಗಳ ಕಡಿಮೆ ತೀವ್ರತೆಯ ಮಿತಿಯನ್ನು ಅನ್ವಯಿಸಲಾಗಿದೆ (ಪ್ರತ್ಯೇಕವಾದ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳಿಗೆ ಹೋಲಿಸಿದರೆ ಮೊನೊಮರ್‌ಗಳು ಒಟ್ಟುಗೂಡಿದ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಮೀರಿಸುತ್ತದೆ ಎಂಬುದನ್ನು ಗಮನಿಸಿ).ಈ ಮಿತಿಯನ್ನು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ ಒಟ್ಟುಗಳನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡುವ ಸಲುವಾಗಿ ಶುದ್ಧ ಮೊನೊಮರ್ ಮಾದರಿಗಳ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಯಿಂದ ಪಡೆದ ಮೊನೊಮೆರಿಕ್ αS ನ ಸರಾಸರಿ ತೀವ್ರತೆಯ ಐದು ಪಟ್ಟು ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗಿದೆ.PIE ಡ್ರೈವ್ ಸರ್ಕ್ಯೂಟ್, TSCPC ಡೇಟಾ ಸ್ವಾಧೀನದೊಂದಿಗೆ, ಹಿನ್ನೆಲೆ ಮತ್ತು ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಲ್ ಕ್ರಾಸ್‌ಸ್ಟಾಕ್ ಅನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ಸಹಾಯ ಮಾಡುವ ಜೀವಮಾನದ ತೂಕದ ಫಿಲ್ಟರ್‌ನ ಅಪ್ಲಿಕೇಶನ್ ಅನ್ನು ಸಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸಿದೆ.ಮೇಲಿನ ಥ್ರೆಶೋಲ್ಡ್‌ಗಳನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿದ ಜ್ವಾಲೆಯ ತೀವ್ರತೆಯನ್ನು ಬಫರ್-ಮಾತ್ರ ಮಾದರಿಗಳ ಸಂಭವಿಸುವಿಕೆಯ ಹಿಸ್ಟೋಗ್ರಾಮ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ತೀವ್ರತೆ/ಬಿನ್‌ಗಳಿಂದ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾದ ಸರಾಸರಿ ಹಿನ್ನೆಲೆ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಬಳಸಿಕೊಂಡು ಸರಿಪಡಿಸಲಾಗಿದೆ.ದೊಡ್ಡ ಸಮುಚ್ಚಯಗಳೊಂದಿಗೆ ಸಂಬಂಧಿಸಿದ ಬರ್ಸ್ಟ್‌ಗಳು ವಿಶಿಷ್ಟವಾಗಿ ಸಮಯದ ಜಾಡಿನಲ್ಲಿ ಹಲವಾರು ಅನುಕ್ರಮವಾದ ತೊಟ್ಟಿಗಳನ್ನು ಆಕ್ರಮಿಸುತ್ತವೆ (1 ms ಗೆ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ).ಈ ಸಂದರ್ಭಗಳಲ್ಲಿ, ಗರಿಷ್ಠ ಸಾಮರ್ಥ್ಯದ ಬಿನ್ ಆಯ್ಕೆಮಾಡಲಾಗಿದೆ.FRET ಮತ್ತು ಸ್ಟೊಚಿಯೊಮೆಟ್ರಿಕ್ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆಗಾಗಿ, ಸೈದ್ಧಾಂತಿಕವಾಗಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾದ ಗಾಮಾ ಅಂಶ γ (0.517) ಅನ್ನು ಬಳಸಲಾಗಿದೆ.ಸ್ಪೆಕ್ಟ್ರಲ್ ಕ್ರಾಸ್‌ಸ್ಟಾಕ್ ಮತ್ತು ನೇರ ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಕೊಡುಗೆಗಳು ಅತ್ಯಲ್ಪವಾಗಿರುತ್ತವೆ (ಪ್ರಾಯೋಗಿಕವಾಗಿ ನಿರ್ಧರಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ) ಪ್ರಚೋದನೆಯ ಲೇಸರ್ ಶಕ್ತಿಯಲ್ಲಿ ಬಳಸಲಾಗುತ್ತದೆ.ಸ್ಫೋಟದಲ್ಲಿ FRET ಯ ದಕ್ಷತೆ ಮತ್ತು ಸ್ಟೊಚಿಯೊಮೆಟ್ರಿಯನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತೆ ಲೆಕ್ಕಹಾಕಲಾಗುತ್ತದೆ.